福建福州厦门代做实验代测实验IHC,WB,PCR,ELISA免疫组化
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福建福州厦门代做实验代测实验IHC,WB,PCR,ELISA免疫组化
多年来,成功为福建厦门各高校系院实验室代测过IHC,WB,PCR,ELISA免疫组化,染色等实验,并文章成功通过。
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Western blot protocol
步骤:
1. 分离胶和积层胶,制胶板;
注意:灌分离胶时不要加太多。
2. 蛋白变性:准备蛋白样本,加入等体积的2×上样Buffer稀释,置于沸水中煮10min(预染marker煮5min)
3. 加样:每孔加入20~40μl样品
4. 电泳:置于电泳槽中电泳45min,恒定电流90mA(2块板),如为1块板则电流为50mA;
5. 取出胶板,用切割刀修好胶;
6. 将胶置于转膜液中浸泡;
7. 按顺序放好下列物质:黑面→海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸(用吸管赶去气泡)→海绵;
8. 置于转膜槽中于,黑面对黑面,加上冰块,加入转膜液;
9. 装好电极,于恒定电压100V下,90min;
10. 丽春红染膜;
11. 用TBST洗去丽春红;
12. 封闭:加入5%脱脂奶粉+TBST,常温摇床摇1h;
13. 回收封闭液,加入一抗【一抗用5%BSA+TBS稀释】;
14. 置于4℃摇床摇过夜;
15. 回收一抗,TBST洗膜,10min,共3次;
16. 加入二抗【二抗用5%脱脂奶粉+TBS稀释】,常温摇床摇1h;
17. 回收二抗,TBST洗膜,10min,共3次;
18. 将膜置于发光液中浸泡约1min;
19. 将膜铺于曝光盒中,于暗室中曝光,洗胶片。
常用溶液配制:
Ⅰ 细胞裂解液(PLC Lysis Buffer)
Final concentration 100ml 500ml
1M Hepes(pH7.5) 50mM 5ml 25ml
5M NaCl 150mM 3ml 15ml
Glycerol 10% 10ml 50ml
50mM MgCl2 1.5mM 3ml 15ml
Triton×100 1% 1ml 5ml
0.5M EDTA(pH8.0) 1mM 200μl 1ml
0.1M NaPPi 10mM 10ml 50ml
0.5M NaF 10Mm 2ml 10ml
每次提取蛋白前加入1%蛋白酶抑制剂
Ⅱ. SDS-PAGE胶配方及其它常用溶液的配制
1.30%丙烯酰胺
丙烯酰胺 29g
N-N’-亚甲双丙烯酰胺 1g
溶于总体积为60ml的水中,加热至37℃使其溶解,补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌或Whatman 1号滤纸过滤,查证该溶液的pH值不大于7.0,置棕色瓶中保存于RT。
注:(1)丙烯酰胺是强烈的神经毒素,可经皮肤吸收,丙烯酰胺的作用具累积性。
(2)称取时,必须戴手套、口罩;取溶液时也要戴手套。
(3)贮存期间,丙烯酰胺和双丙烯酰胺缓慢转化为丙烯酸和双丙烯酸,这一脱氨反应是光催化和碱催化的。应检查丙烯酰胺溶液的pH值是否在7.0或更低,并应在RT下避光保存。每隔数月应重新配制溶液。
2.3M Tris-HCl,pH8.8(用于分离胶)
Tris碱分子量为121.1。将72.66gTris碱溶于重蒸水(不超过200ml)中,加浓盐酸调节pH至8.8,让溶液泠却至RT,再最终调至所需pH值。加重蒸水定容至200ml,1.034×105 Pa,20min高压灭菌,RT贮存。
注:(1)如溶液呈现黄色,应予丢弃,并置备质量更好的Tris.
(2)Tris溶液的pH值因温度而异,温度每升高1℃,pH值大约降低0.03个单位。
3.2M Tris-HCl,pH6.8(用于积层胶)
同上方法,将48.44gTris碱加重蒸水定容至200ml,加浓盐酸调节pH至6.8。
4.10%十二烷基硫酸钠(SDS)
在900ml水中溶解100g电泳级SDS,加热至68℃助溶,加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2,加水定容至1L,分装备用。
注:SDS的微细晶粒易于扩散,因此称量时要戴面罩,称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS,10%SDS溶液无须灭菌。
5.TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用,因此pH值较低时聚合反应受到抑制。
6.10%过硫酸胺
过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(W/V)的贮存液于保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解,故应隔新鲜配制。
方法:把1gAPS溶解于终量为10ml水溶液中,4℃保存数周。
7. 电泳缓冲液SDS buffer: 10X(running buffer)
Tris base 30.3g
Glycine 144.0g
SDS 10.0g
ddH2O to 1L
(1X conc: 25mM Tris base, 192mM glycine, 0.1%SDS,)
8. 转膜缓冲液Transfer Buffer(10×) pH8.3
Tris base 30.3g
Glycine 144.0g
20%v/v methanol (Fresh!)
ddH2O to 1 L
(1X conc: 25mM Tris base, 192mM glycine, 200ml methanol)
9. TBST(10X) pH: 7.5
Tris base 24.2g
NaCl 80.0g
Tween-20 10 ml
ddH2O to 1L
(1X conc: 100mM Tris base, 150mM NaCl, 0.1%Tween20)
10.Tris缓冲盐溶液(1X TBS,25mmol/L Tris)
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Tris碱 3.0g
溶解于800ml蒸馏水中,加入0.015酚红并用HCl调pH值至7.4,用蒸馏水定容至1L,分装后在15lbf/in2(1.034×105 Pa),高压下灭菌20min,RT贮存。
11.发光剂
100mM Tris Base(pH8.5) 10 ml
250mM Luminol (in DMSO) 50 μl
90mM P-Coumaric Acid (in DMSO) 22 μl
30%H2O2 2.75 μl
SDS-PAGE Mini-Gel Recipes
7%Running Gel
gels 2 4
Acrylamide:bis-acrylamide (ml) 4 8
3M Tris-HCL, pH 8.8 (ml) 1.5 3.0
ddH2O (ml) 6.28 12.56
10%SDS (ul) 120 240
10%APS (ul) 100 200
TEMED (ul) 6 12
10%Running Gel
gels 2 4
Acrylamide:bis-acrylamide (ml) 2.8 5.6
3M Tris-HCL, pH 8.8 (ml) 1.5 3.0
ddH2O (ml) 7.48 14.96
10%SDS (ul) 120 240
10%APS (ul) 100 200
TEMED (ul) 6 12
12%Running Gel
gels 2 4
Acrylamide:bis-acrylamide (ml) 4.8 9.6
3M Tris-HCL, pH 8.8 (ml) 1.5 3.0
ddH2O (ml) 5.48 10.96
10%SDS (ul) 120 240
10%APS (ul) 100 200
TEMED (ul) 6 12
15%Running Gel
gels 2 4
Acrylamide:bis-acrylamide (ml) 6 12
3M Tris-HCL, pH 8.8 (ml) 1.5 3.0
ddH2O (ml) 4.28 8.56
10%SDS (ul) 120 240
10%APS (ul) 100 200
TEMED (ul) 6 12
Stacking Gel
gels 2 4
Acrylamide:bis-acrylamide (ml) 0.75 1.5
2M Tris-HCL, pH 6.8 (ul) 375 750
ddH2O (ml) 4.8 9.6
10%SDS (ul) 60 120
10%APS (ul) 150 300
TEMED (ul) 3 6
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