来宝网 2012/6/18点击2121次
一、细胞的准备
试验一：组织培养细胞的细胞准备
材料
完全培养基 流式细胞仪染色液 15或50ml尖底离心管
实验过程
1． 对于悬浮培养的细胞，把细胞分装到一个尖底离心管中，对细胞进行计数和活性分析，然后进入步骤3；
2． 对于贴壁培养的细胞，用完全培养基从培养皿上吹起并吹散细胞凝聚物，然后把细胞分装到一个尖底离心管中，对细胞进行计数和活性分析，进入步骤3；
3． 离心细胞然后用流式细胞仪染色液重悬细胞使其终浓度为2×107个细胞/ml。
试验二：淋巴组织的细胞准备
材料
60×15 mm 组织培养皿
3 ml注射器
细胞滤网（血液尼龙滤网）
流式细胞仪染色液
15或50ml尖底离心管
实验过程
1． 采集组织（采集组织（脾，淋巴结，胸腺）放进一个细胞培养皿中，用3 ml注射器的活塞挤压以制成单细胞悬液，此过程用10ml的染色缓冲液；
2． 加入10ml染色液收集细胞，使细胞悬液通过尼龙滤网以除去成团的细胞和细胞碎片，收集细胞悬液于尖底离心管中；
3． 4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液；
4． 重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析；
5． 按照步骤3离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。
试验三：非淋巴组织的细胞制备
材料
剪刀或者手术刀片
PBS
60×15 mm 组织培养皿
3 ml注射器
细胞滤网（血液尼龙滤网）
流式细胞仪染色液
15或50ml尖底离心管
实验过程
1． 采集组织，用剪刀或手术刀切成2-4mm的小块；
2． 按照酶的使用说明书，加入适量用PBS稀释的酶，孵育。
3． 用移液管轻轻吹散细胞，并用滤网过滤除去成团的细胞和细胞碎片；
4． 4℃离心细胞悬液4-5分钟（300-400g），弃掉上清液；
5． 用PBS重悬细胞沉淀以移除剩余的酶溶液；
6． 重复步骤4；
7． 重复步骤5和6；
8． 用流式染色液重悬细胞沉淀，细胞计数和活性分析；
9． 按照步骤4离心细胞然后用合适体积的染色液重悬细胞，使细胞终浓度为2×107个细胞/ml。
二、用淋巴组织细胞悬液在流式细胞仪上分析以前，最好去掉红细胞。
试验一：鼠脾细胞中红细胞的裂解：
材料
1×PBS
eBioscience 红细胞裂解液
50ml 尖底管
1． 采集小鼠的脾脏并且制成单细胞悬液；
2． 4℃ 离心沉淀细胞（300-400g），弃掉上清液；
3． 用5ml脾的红细胞裂解液重悬细胞；
4． 室温震荡孵育4-5分钟（也可在冰上进行）；
5． 加入20-30ml PBS 停止反应；
6． 4℃ 离心沉淀细胞（300-400g），然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀，继续下一步试验；
7． 细胞计数。
试验二：小鼠血液的红细胞裂解
材料
1×PBS
eBioscience 红细胞裂解液(Cat.No.00-4333)
50ml 尖底管
1． 1ml小鼠血液中加入10ml 红细胞裂解液；
2． 室温震荡孵育4-5分钟（也可在冰上进行）；
3． 加入20-30ml PBS 停止反应；
4． 4℃ 离心沉淀细胞（300-400g），然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀，继续下一步试验；
5． 细胞计数。
试验三：人外周血中红细胞的裂解
材料
1×PBS
eBioscience 红细胞裂解液
50ml 尖底管
1． 1ml人的血液中加入10ml 红细胞裂解液；
2． 室温孵育10分钟（不要超过15分钟）；
3． 加入20-30ml PBS 停止反应；
4． 4℃ 离心沉淀细胞（300-400g），
然后用合适体积的缓冲液重悬细胞沉淀，继续下一步试验；
