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Western Blot 为什么必须要用内参？
背景：
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4 个30－40kDa的亚基组
成，分子量146kDa。GAPDH 基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot
蛋白质标准化的内参。
注：因为GAPDH 作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的。在
实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的
操作误差；这些误差需要通过测定每个样品中实际转到膜上的GAPDH 的含量来进行校正，
所以一般的western实验都需要进行内参设置。具体校正的方法就是将每个样品测得的目的
蛋白含量与本样品的GAPDH 含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。然后才进行样
品与样品之间的比较。
反应：
抗GAPDH 单抗（clone 6C5）能够与鱼、蛙、鸡、兔、小鼠、大鼠及人组织来源的GAPDH
反应，但不能与酵母GAPDH 反应。
应用：
GAPDH 检测。Western Blotting(检测条带大约在36kDa，稀释比例达10，000 倍)、ELISA、
亲和纯化、免疫荧光及免疫组化。
图示:抗GAPDH 单抗（Cat＃KC-5G4）检测心脏组织匀浆中的GAPDH 水平。A-G分别表示
不同实验来源的心脏组织匀浆。抗GAPDH 单抗稀释比例为1：10，000，HRP 羊抗鼠二抗
（Cat＃KC-MM-1302）稀释比例为1：1000。采用SuperSignal West Pico Chemiluminescent
Substrate Kit试剂盒及X 胶片曝光显影。
摘要：
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western
Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目
的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令
人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问
题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，
而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，
严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别
是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。
良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体
对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有
内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导
致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。
内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，
目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不
高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码
表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的
表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、
蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参
的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，
国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为
规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存
在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较
纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干
扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，
Bradford，Lowry 等几种方法。BCA 法与Lowry 法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干
扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基
乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样
品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也
存在操作误差。在Western blotting 实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的
误差进行校正。
在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内
参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相
对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可
信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色
或者发光体系是否正常。
实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测
样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内
参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋
白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参
显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至
内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦
一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作。
常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白
beta-actin 或beta-tubulin。最近的国外文献报道中使用GAPDH 内参的较多。
在Western Blotting实验过程中，由于使用的二级抗体往往会与总蛋白中本身含有的某些免
疫球蛋白产生反应产生较强信号的杂带。

附：在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、 超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操
作即可。
二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行
目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip 缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋
白的抗体温育、显色检测。
三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转
膜后预染，根据蛋白质Marker 的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与
目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及
显色。