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 BioRam活体单细胞倒置共聚焦显微拉曼激光光谱仪 

—激光拉曼光谱非侵入、无损伤、高灵敏高度特异性、快速活态单细胞鉴别、分选隔离系统 
BioRam–Identifying and characterizing 、sorting single cells without labelling，Raman spectroscopy for single cells

背景： 
癌症仍然是死亡的最常见原因之一，只有很少有人知道它的经历。在早期，对细胞进行无损伤鉴定、识别以及准确分析出单个细胞活力、生存状态、所处状态、所在分化阶段、是否病变对临床治疗具有重要意义。 
拉曼散射技术与荧光光谱、红外光谱等技术相比，不仅具有可在无须荧光标记情况下对活细胞进行基本无扰、原位测定无需标记、无需制备的优点，而且拉曼光谱不受水的干扰。故拉曼光谱技术在研究测定活细胞尤其是连续监测单个活细胞上有无可比拟的突出优点。 
利用拉曼光谱技术对样品进行无损分析,具有测试样品非接触性、非破坏性、检测灵敏度高、时间短、样品所需量小及样品无需制备等特点。在分析过程中不会对样品造成化学的、机械的、光化学和热的分解，是分析科学领域的研究热点之一,被广泛应用于医学、药物、文物考古、宝石鉴定和法庭科学等方面。 
基于拉曼显微光谱技术的单细胞分选方法无需外加标记，可无损获得整个单细胞的化学物质指纹图谱，从而迅速识别活体单细胞的种系发生、生理特性和代谢产物变化等，因此对于难培养微生物的功能鉴定和资源开发具有重要意义。

概述:
BioRam是一个基于拉曼光谱的细胞鉴定系统。这无标记和非侵入性的方法提供了具有高度特异性分子信息。实时动态监测生物分子细胞发育过程中发生的变化。研究疾病、药物或毒素的细胞反应。 
BioRam 活态单细胞激光拉曼光谱无损测定鉴别系统可在无任何标记情况下对活细胞进行三维扫描测定其分子分布，更具优越性。BioRam活体单细胞显微激光拉曼光谱仪为医师，药师和生物学家提供了利用拉曼光谱的便利的工具，BioRam系统中显微镜，拉曼光谱和特殊定制软件的创新组合，不仅可以识别各种基团，还可以对化合物进行高精确度分析，且对活细胞不需要使用生化标记物，荧光标记物或者抗体，对活细胞绝对安全。 
与FACS相比，活体单细胞拉曼分选功能的核心优势在于对细胞生化信息及其变化敏感、不需预知生物标识物、不需标记细胞、原位和非侵害性的活体检测等 
因此，活体单细胞拉曼分选可有效克服“细胞功能异质性”、“尚不可培养微生物”、“探测未知的细胞表型”等三个共性科学与技术瓶颈.
2、系统亮点概述 
—快速、无标记 、具有高度特异性、灵敏、非破坏性 
—CellTool是融合了关键光学技术与微流体和定制软件的集成系统，以满足生物样品工作的具体要求和挑战 
技术特点及亮点 
拉曼光谱(Raman Spectroscopy)、微激光器(Microlaser technology)、微流控多种技术体系结合的多重保障。 
微激光器用来非接触式显微操作和进一步鉴定不能通过拉曼光谱来区分的非常相似的细胞； 
微流控芯片用来提高吞吐量（连续流动系统）和活细胞的非接触式分选； 
2.1高精确度、无需生化标记物,荧光标记物,抗体或磁珠活体细胞鉴别、表征-活细胞绝对安全 

2.2对于细胞活力和培养性没有限制 
相对于利用FACS或MACS原理来进行细胞识别的仪器，BioRam拉曼光谱仪无需使用磁珠、生化标记物、荧光标记物、无污染，可在整个过程中保持细胞的活性。测试后的细胞可以传代培养以用于进一步的实验。在这种过程中，由于细胞的活性保持不变，所以可以对癌细胞的特征进行分析，并可以对它们与各种活性物质相互作用的效果进行分析。BioRam的应用范围涵盖从生物研究到临床实践，可对病人的具体治疗决策进行支持。 

对细胞表面氨基酸的拉曼指纹图谱分析图 
2.3即使在液体环境中，也可对细胞进行精确分析—非侵入、无损伤细胞鉴别、分选的新模式 
生物大分子多是处在水溶液环境中，研究它们在水溶液中的结构对于了解生物大分子的结构与性能的关系非常重要。由于水的红外吸收很强，因此用红外光谱研究生物体系有很大局限性，而水的拉曼散射很弱，干扰小，而且单细胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质含量等大量信息，可在不损伤细胞的条件下实时动态地监测细胞分子结构变化，可以对细胞、病毒等进行原位检测分析。 
并非所有的细胞都具有清晰可辨的表面标志物。但在区分癌细胞与健康细胞、或干细胞等具有分化能力的细胞过程中，Rarnan光谱显著优于其它方法。BioRam技术可以对细胞表面基团标志物进行精确分析，例如对于红细胞，白细胞，急性髓性白血病细胞或乳腺癌细胞等[2，3]。所以该技术可以对未定影的组织或活检材料，如致病血液细胞等进行诊断快速和可靠地识别。同样，干细胞也可以应用这种原理从外周血或脐带血中分离出来，以用在对它们的自然状态的研究或治疗方法中。 

图3 对于不同血液细胞的拉曼光谱分析 
2.4样品不用特别制备，测量技术简单易行 
样品不用特别制备。可以直接使用活体组织或在水溶液中对细胞进行测量。同样，细胞可以放在与拉曼光谱仪兼容的培养皿中或者微流控芯片中分析。直接“点击运行”即可获取高质量光谱数据，所产生的光谱与拉曼数据库比较可以分析细胞类型和状态。同时，原始数据和所有显微镜和激光的设置参数也被保存，为测量的后续实验提供依据，以进行进一步的分析。 
2.5 非侵入、快速培养组织分析 

 该BioRam系统可对培养组织进行快速、非侵入性分析。例如，在自体软骨移植的软骨细胞的生存能力和纯度以及它们的分化状态可用BioRam系统进行Raman光谱的测试[4]。此外利用BioRam系统对人类皮肤成纤维细胞，角质形成细胞，黑素细胞和角质形成细胞在活体条件下进行的分析[5]，在间充质干细胞的培养过程中，基质成纤维细胞的污染也被证实具有高度的特异性 [6]。这开辟了许多可能的应用领域，例如在在细胞培养和组织工程中监测和质量控制。 

2.5）利用仿生水凝胶和拉曼光谱分析的体外肿瘤-基质共培养模型 
定义和可再现器官组织培养模型是可靠的分析研究和药物筛选的先决条件。仿生水凝胶中肿瘤-基质共培养模型，其由乳腺肿瘤细胞系（MCF-7）和原代皮肤成纤维细胞组成，来研究肿瘤-基质相互作用所引起肿瘤恶化。 
拉曼光谱（RS）是一种高度灵敏的分子光谱技术，基于聚焦激光与细胞中的全部生物的交互。拉曼光谱以完全无损的方式和可以作为“光子标记”来表征细胞和细胞状态进行洞察细胞代谢。我们使用了拉曼光谱来表征由于肿瘤- 基质的相互作用引起的细胞变化。 
2.6）拉曼样品用量少、不需要对生物样品进行繁琐的前处理程序, 操作简单,，不会损伤样品 
拉曼样品用量很少，不需要对生物样品进行固定、脱水、包埋、切片、染色、标记等繁琐的前处理程序，不仅操作简单，而且不会损伤样品从而能够获得样品最真实的信息 
2.7) BioRam系统克服了传统光谱系统的生物样品自身荧光的干扰生物样品微弱拉曼信号，BioRam系统最佳激光波长、测验过程的生理条件，保证了样品的活力。 
3．原理： 
原理：从细胞的生物光子分布识别细胞 
该系统是倒置显微镜、数字相机对活细胞进行不同扫描模式(点扫描、线扫描与二维扫描)的扫描参数优化，对单个细胞的拉曼化学指纹图谱（细胞生化信息）的获取并与参照细胞拉曼数据库比对，从而原位、不依赖于培养、高通量地识别、分选具有特定生化状态的单细胞 
4.用途及适用范围 
用途： 
4.1无需标记和在生理条件下,甚至流体中确定细胞类型和活动状态 
—基于拉曼图谱的细胞种类、活动状态、分化阶段、生长状态快速鉴别功能 
单细胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质含量等大量信息，可在不损伤细胞的条件下实时动态地监测细胞分子结构变化，可以对细胞、病毒等进行原位检测分析。 
基础研究包括组织结构及成分鉴别（脂类、蛋白质、糖类、水、DNA，RNA等）、细胞的定位、鉴别及分类(归类)等。 
拉曼是分子的“指纹图谱”, 生物分子的指纹区主要出现在100-2000cm-1，如图1左。拉曼对分子所处的环境非常敏感，结构上的细微差异都能在拉曼谱图上体现出来，如下图1右 

 
图1 左：甲状腺肿和恶性肿瘤的拉曼谱图；右：不同肌红蛋白拉曼谱图 
下图是3种不同的细菌在不同生长时间下获得的拉曼结果进行的统计分析，结果显示对于同一细菌，尽管生长时间不一样，但是它们都被归属于同一类，证明拉曼可以很好地鉴别不同种类的细胞

其中a、b、c分别代表三种不同细菌的训练数据，而粗体的a、b、c代表测试数据（英国CEH Oxford的Wei Huang博士提供的数据） 
4.2区分不同的干细胞类型或确定它们的分化阶段； 
4.3对人体标本具有较高的特异性分析能力，识别具有高灵敏度极为罕见、不明确的细胞； 
4.4拉曼样品用量少 
4.5基于细胞拉曼指纹图谱的活体单细胞拉曼分选(分析BioRam专门流体芯片来分选细胞) 
4.6在无剪切力、无生理上的压力情况下对样品分析，使细胞保持活力利于下游应用。 
4.7监测并记录在细胞和组织培养细胞过程中的变化； 
4.8分析培养的细胞和活性物质之间的相互作用。 
4.9）通过人体正常组织与病变组织细微差异的拉曼光谱分析，在早期识别病变的细胞组织 
拉曼光谱可以从分子水平提供信息，这对于很多疾病的研究有着重要的意义。不同病变会在拉曼谱图中有不同的特征显示，通过拉曼光谱能够对不同疾病进行判断 
传统的检测手段（比如病理标本染色法）只能检测出与健康组织有明显区别的病变组织，而拉曼可以获得细胞组织细微的化学结构信息，即使是早期肿瘤，由于其DNA含量会急剧增加，拉曼可以捕捉到这些变化，表现在拉曼成像图中。即可在更早时期发现诊断病变。 
 
图5 肿瘤细胞早期诊断 
左上：未染色鼠脑组织显微图像；左下：伪彩拉曼成像图； 
右：不同组织拉曼谱图，包括健康组织（胼胝体，皮质和血液）以及病变组织（早、晚期肿瘤） 
（法国兰斯大学Manfait教授及其同事提供的数据） 
如图5中早期肿瘤（绿色）和晚期肿瘤（红色）的DNA拉曼峰强要明显高于健康组织（胼胝体，皮质和血液）。拉曼成像图中红色区域的晚期肿瘤与染色法诊断出的病理学吻合，而绿色区域的拉曼谱图与红色区域的谱图一致，说明已经发生病变，然而染色法却没有将其检测出来。 
4.10药物研究： 
4.10.1）药物成分分布、定性、定量分析 
拉曼光谱中不同成分信息的提取可以得到药片成分分布的图像，透射拉曼则能获得整个药片的平均信息，可以对整个药片进行准确的定性、定量分析，从而能够测定不同批次或不同厂家药物含量的均匀度、进行真假药鉴定、过程监控排错 
4.10.2）药物与细胞之间相互作用的研究 
由于拉曼光谱是无损的检测方法，它还可以用于药物与细胞之间相互作用的研究。 
如药物与细胞作用的位点、在细胞中的分布、药物在细胞内的动力学研究等等。因此，拉曼光谱也在药物的筛选等工作中有着广泛应用
 
药物作用于细胞后的拉曼成像结果图 

图4 BioRam拉曼光谱仪可监测并记录在细胞培养过程中的变化 

适用范围

细胞培养和药物筛选

识别不同的细胞群
指定相关的生物分子
探索亚群体
监测细胞状态及开发线和上线
验证实验结果 

干细胞与再生医学

鉴定的干细胞群 
检测和监控分化 
求证分化细胞的功能 
呈现组织产品的细胞组成 
筛选是否受到污染