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涨知识|qPCR专场八：细节-认真的态度和科学的精神

来宝网 2023/10/8点击672次

涨知识|qPCR专场八：细节-认真的态度和科学的精神

 

荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种检测方法。该方法通过在PCR体系中添加荧光基团来记录DNA产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的，并且可以通过数据分析计算出起始模板量，这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。

 

荧光定量PCR实验需要用心对待，各种细小的偏差都会导致实验出现结果不准确或难以理解的现象。小事成就大事，细节成就完美。接下来小翌给大家来介绍一下荧光定量PCR中需要注意的小细节。

 

 

 
RNA保证可用
 
RNA的完整度在很大程度上影响着cDNA合成的长度与质量。在进行RNA提取、处理、储存等实验过程中需要采取特殊的保护措施，如操作者佩戴手套和口罩，全程使用无RNA酶污染的实验耗材等；RNA存储尽可能采用-80℃保存，且减少反复冻融。

RNA的完整性可通过Agilent 2100生物分析仪进行分析，其在分析RNA完整性之后能够给出准确的数值（RIN值，全称 RNA Intesity Number），该值在8-10之间表示RNA质量非常好，小于7时表示RNA完整度较差。

 

 

但是在多数实验室中，一般不会有Agilent 2100生物分析仪。在这种情况下，我们可以采用一种最快速的方式检测RNA完整性---凝胶电泳。进行RNA凝胶电泳时，需要保证全程无核酸酶干扰的风险。电泳槽、配制瓶、制胶套件、电泳槽用DEPC水冲洗干净，琼脂糖和电泳液需要是新开封的，从而保证RNA在上样及电泳过程中不会被核酸酶降解。电泳时需要合理选择电压和电泳时间，电压过高或长时间电泳会产生大量热量，从而导致RNA降解。

 

▲高质量的RNA电泳会有三条比较明显的条带，分别是28S，18S与5S核糖体RNA条带，并且28S与18S的条带亮度之比大体为2：1。当RNA出现降解时，条带会呈现弥散状。

 

 

 
前期准备稳妥
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
01

实验仪器的准备

常用的移液枪和进行荧光定量PCR的qPCR仪器需要确认定期有做过校正，通常校准周期是一年，从而保证加样的准确性和检测的准确性。移液枪在使用之前用酒精擦拭枪杆并擦干放置一会儿，以减少污染的风险。

 

02

 

内参基因的准备

 

为了使用实时荧光定量PCR对所选基因进行准确且可重现的表达分析，使用可靠的内参基因在实验之间标准化表达水平至关重要。GAPDH、β-actin和18S rRNA等是最为常见的内参基因，但是无论选择哪个基因作为内源性对照，都必须对该基因进行测试，以确保在所有所需的实验条件下基因的一致表达。

 

  • GAPDH不适合选作内参的情况

    GAPDH基因是糖酵解中的关键基因，在代谢过程中的表达很容易受到多种因素的影响。如在细胞的增殖过程中，细胞需要的能量ATP增多，糖酵解代谢加大，GAPDH基因的表达水平很有可能被上调。有报道称，该基因可作为肿瘤发生的标志物，在肿瘤组织与正常细胞及癌旁正常组织比较时，GAPDH表达并不一致。故在比较肿瘤组织与正常组织或细胞的某种基因或蛋白的表达时，GAPDH作为内参应慎重。

     

  • β-actin不适合选作内参的情况

    对于actin蛋白由几种异构体组成，actin大致可以分为6种，不同actin之间具有较大的序列相似性(>90%)。在肌肉组织中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的组织都适合选β-actin作为内参。例如当细胞向恶性转化时，β-actin mRNA的表达水平增加；而假基因的存在也可干扰β-actin的检测，此时并不适合选择β-actin作为内参。

     

  • 18S rRNA不适合选作内参的情况

    rRNA的转录易受到各种生物因素和药物的影响。在有丝分裂期间，28S、18S rRNA明显减少或停止表达。此外存在很大争议的是rRNA不包括poly(A)尾，在以oligo(dT)为引物的cDNA合成中不能被逆转录，建议在反转录的过程中除用oligo(dT)引物外，还要用18S作为反向引物，反转录后的cDNA最好用RNA酶处理一下，再高温灭活。

     

▲确定用于人胰腺器官组织 RT-qPCR 分析的最佳内参基因(Cherubini, Alessandro et al. PloS one. 2021)
 
如何选用合适的内参？
 
03
靶标基因引物的准备
进行引物设计后，进行预实验验证，选取扩增效率在90%-110%(最佳95%-105%)之间，且熔解曲线为单峰的引物。

 

 

 
注重加样细节
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
01

加样环境需保证

荧光定量PCR实验的灵敏度很高，在配制预混液的时候需在超洁净平台中进行，以防止外源的污染。一些预混液在室温下是稳定的，但最佳做法是将试剂成分、酶和样品保存在冰上。另外在进行染料法(SYBR)荧光定量实验时, 需要避免强光照射，强光照设会导致SYBR淬灭。

 

02

试剂准备需注意

不要涡旋震荡含酶的混合物，因为其对干扰高度敏感。仅轻轻旋转或颠倒含酶的预混液即可。PCR引物和解冻的核酸可以通过轻轻且短暂的涡旋混合一到两秒钟。

 

03

加样过程需谨慎

  • 加样顺序尽量选用先加大体积，后加小体积的方式；先加NTC，后加模板。加样顺序的把控可尽可能减少操作误差和污染风险。
     
  • 枪头勤更换，以减少交叉污染的风险。在重复组和样品类型之间需在每次吸取后更换枪头。在加样过程中，不要让枪头穿过其他孔或不同的样品/检测类型。
     
  • 灵活使用移液枪，尽可能提升孔间重复和加样精准。针对10 μL及以下的小体积液体吸取，采用二档吸取(按到底)，一档排出(不按到底)。当孔中有液体时，小体积液体加样，需选用低吸附枪头伸入至液面以下进行排出，减少液体残留在枪头内的现象。

     

04

密封、混合需全面

  • 加样至96孔板前后，切勿使用记号笔等在板的表面或者板底部写字，这会干扰荧光激发和信号检测。另外类似墨水等物质可能会在qPCR仪器中从板上转移至仪器模块上，这类有色或荧光物质污染模块后会对当前乃至后续的荧光定量PCR数据产生不利影响。用封板膜封板后，需检查板的顶部以及验证是否与板良好接触，尤其是边缘部分。
     
  • 在正式上机前需对反应组分充分离心混合，若混合不均匀，精准度和效率可能会受到影响。另外需检查孔中是否存在气泡或黏附在孔壁上，若存在，需轻轻敲击管子底部后短暂离心，从而消除溶液中的气泡。

 

 

 
全面程序检查
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

除了根据说明书仔细调整设置好反应的温度、时间和循环次数外，还需要注意以下事项：
  • 反应体积是否填写正确---需按照实际反应体积来进行填写；
     
  • 延伸环节荧光采集开关是否打开---若荧光采集开关未打开，则会发生无扩增曲线的现象；
     
  • 熔解曲线程序不同仪器各不相同，上图中仅以Abi Q5为例，通常选用仪器默认的信号采集程序即可。

 

以上是对荧光定量PCR实验中细节注意的介绍，相信小伙伴们通过小翌的介绍，今后会针对这些细小问题已经有一定的信心啦。关于如何做好qPCR实验，小翌本次给大家展示的是最终章啦，从专场一到专场八，小翌针对荧光定量PCR实验中可能出现的问题和困惑做了针对性介绍，希望能够对小伙伴们的实验有所帮助。当然，还有很多知识，小翌还没有介绍到，小伙伴们不要忘记自主学习哦！

 

 

 
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