来宝网 2022/4/24点击1947次
——Protein A /G 琼脂糖或磁珠
Protein A、Protein G是最常应用于抗体亲和纯化和免疫沉淀的蛋白。 Protein A/G琼脂糖或磁珠将Protein A、G共价偶联到介质表面，具有结合能力更强、结合范围更广、实用性更高的特点。
Protein A/G 4FF Agarose | Protein A/G MagBeads | |
基质 | 高度交联4%琼脂糖微球 | 聚合物磁性微球 |
填料粒径 | 45-165 µm | 1 µm |
载量 | >20 mg 人IgG/mL | >50 µg 人IgG/mg |
优势 | 简单易用，无需辅助设备 | 操作简单 |
孔径大，结合力强 | 直径小，动力学好 | |
靶蛋白获取量高 | 表面光滑，beads吸附很少，背景低，抗体消耗少 | |
缺点 | 多孔易吸附（需要做pre-clear) | 配套磁力架使用方便 |
1、纯化抗体：一步纯化即可从血清或腹水样品中分离出高纯度的抗体。
2、免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）：通过对某蛋白质的富集，研究该蛋白的特性（如翻译后修饰等）。
3、免疫共沉淀Co-IP(co-Immunoprecipitation)：通过对某蛋白质的富集，研究与其结合的其他蛋白（即蛋白-蛋白相互作用、蛋白复合物等）。
1、Protein A/G 4FF Agarose纯化兔血清中的抗体。
图1 Protein A/G 4FF Agarose纯化抗体结果电泳图
2、整个实验设计中，为了进一步阐明Atuveciclib在IL-1b诱导的基质降解中的作用。研究人员在IL-1b刺激30 min前，先利用Atuveciclib预处理人和大鼠NP细胞2h，然后使用针对p65和细胞周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）的特异性抗体对提取的总细胞蛋白进行免疫沉淀分析。结果发现， IL-1b刺激增强了p65和CDK9之间的相互作用，而Atuveciclib减弱了这种作用。
Fig 2. Immunoprecipitants were then subjected to western blot analysis using specific antibodies against CDK9 and p65.
1、Co-IP背景较深或者条带杂乱
● 固相基质的非特异性结合
● 抗体结合非特异的蛋白
● 洗涤不当造成杂带
● 建议方案：pre clear或者更换磁珠；设置对照排除非特异性条带；优化缓冲液
2、Input条带清晰，co-IP条带很弱？
设X为诱饵蛋白，Y为靶蛋白，有可能为
● X和Y的相互作用本身比较弱
● X蛋白并不是Y的唯一，只部分Y与X互作
● 可以尝试反向拉，比如用Y去拉X，可能效果比较好
3、我的蛋白正好和抗体重链分子量接近，要如何减少抗体干扰？
● IP/WB一抗使用不同种属来源，选择与IP抗体种属无交叉反应的二抗(Cross Adsorbed secondary antibody)
● 特殊二抗：比如仅识别重链或者轻链的二抗，或者仅识别天然抗体的二抗
● 直接源头遏制：将抗体直接交联到bead上，或者将抗体交联到protein A/G上，避免洗脱干扰
4、靶蛋白没有条带
● 裂解液不合适，或者没有添加抑制剂，导致靶蛋白或者饵蛋白构象改变不能结合或者降解
● 饵蛋白较难洗脱，换成高强度的洗脱缓冲液
● 选用的抗体不合适，建议IP验证过的抗体，并优化下抗体用量
● 蛋白间为弱相互作用，或者相互作用依赖翻译后修饰
5、琼脂糖难离心，每次总会吸上来一点儿
● 使用带滤膜的离心柱，下部有接样管，琼脂糖完全截留在滤膜上
● 换成磁珠
6、我的目的蛋白因为没有对应的特异性抗体而无法进行免疫沉淀
● 若此蛋白带标签，可选择针对此蛋白的标签抗体来进行免疫沉淀。
产品名称 | 货号 | 规格（mL） | 价格（元） |
36403ES03/05/08/25/60 | 1/2/5/25/100 | 278/538/878/2886/7426 | |
36404ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 978/3186/8726 | |
36417ES03/08 | 1/5 | 787/2937 |
产品名称 | 货号 | 规格（mL） | 价格（元） |
36401ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 546/2186/7426 | |
36402ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 866/2656/8856 | |
36403ES03/05/08/25/60 | 1/2/5/25/100 | 278/538/878/2886/7426 | |
36404ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 978/3186/8726 | |
36405ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 546/2186/7426 | |
36406ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 978/3186/8726 | |
36407ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 2488/9988/16488 | |
36408ES08/25/60 | 5 /25 /100 | 2868/13288/27688 | |
36409ES03/08 | 1 mL/5×1 mL | 528/2218 | |
36410ES08/25 | 5 mL/5×5 mL | 1848/6838 | |
36413ES03/08 | 1 mL/5×1 mL | 528/2218 | |
36414ES08/25 | 5 mL/5×5 mL | 1848/6838 | |
36415ES03/08 | 1 mL/5×1 mL | 938/3748 | |
36416ES08/25 | 5 mL/5×5 mL | 3528/14088 |
文献引用
[1] Wang X , Yu C , Wang C , et al. Novel cyclin-dependent kinase 9 (CDK9) inhibitor with suppression of cancer stemness activity against non-small-cell lung cancer[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2019, 181. IF: 5.201
[2] Zheng L, Xiang C, Li X, et al. STARD13-correlated ceRNA network-directed inhibition on YAP/TAZ activity suppresses stemness of breast cancer via co-regulating Hippo and Rho-GTPase/F-actin signaling[J]. Journal of hematology & oncology, 2018, 11(1): 72. IF：7.33
[3] Jiang S, Liu Y, Shen Z, et al. Acetylome profiling reveals extensive involvement of lysine acetylation in the conversion of muscle to meat[J]. Journal of proteomics, 2019, 205: 103412. IF：3.537
[4] Gao L, Guo Q, Li X, et al. MiR-873/PD-L1 axis regulates the stemness of breast cancer cells[J]. EBioMedicine, 2019, 41: 395-407. IF：6.68
[5] Xie Y, Peng J, Pang J, et al. Biglycan Regulates Neuroinflammation by Promoting M1 Microglial Activation in Early Brain Injury after Experimental Subarachnoid Hemorrhage[J]. Journal of neurochemistry, 2019. IF：4.26
[6] Zhao Q, Liu Y, Wang T, et al. MiR-375 inhibits the stemness of breast cancer cells by blocking the JAK2/STAT3 signaling [published online ahead of print, 2020 Jul 30]. Eur J Pharmacol. 2020;884:173359. IF: 3.263
经典文章分享：抗体亲和纯化系列——抗体纯化，若有选择，必是首选
