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非特异扩增是PCR实验中的常见问题，非特异扩增直接影响检测结果的判读并且会导致扩增灵敏度下降，甚至目标片段的得率下降等。此外，检测试剂的稳定性也是核酸检测行业人格外关注的问题，不管是长期储存稳定性还是短期偏离正常保存条件的稳定性，都直接影响检测结果的有效性。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司（以下简称“翌圣生物”）匠心开发出热启动Taq酶双封闭抗体，通过同时封闭Taq酶的聚合酶活性及外切酶活性来有效提高扩增的特异性及试剂的稳定性。

传统的Taq DNA聚合酶抗体可以有效抑制Taq酶的聚合酶活性，从而避免错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。然而Taq酶除了具有5'→3'聚合酶活性，还有5'→3'核酸外切酶活性，这部分外切酶活性可能会在低温时导致错配探针或其它物料降解，造成非特异信号。翌圣生物开发的热启动Taq酶双封闭抗体不仅可以封闭Taq酶的有5'→3'聚合酶活性，还能同时封闭Taq酶的5'→3'外切酶活性，双管齐下，既能有效防止错配或引物二聚体引起的非特异性扩增，又能防止物料降解产生非特异信号，双重提升试剂的稳定性。

图1. 翌圣双封闭抗体封闭原理示意图

图中高亮部分为Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性结构域和5'→3'核酸外切酶活性结构域，翌圣双封闭抗体含两种抗体，可同时封闭Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性

翌圣生物Taq酶双封闭抗体不仅可封闭野生型Taq酶，对于多种突变体Taq酶亦可适用，封闭之后的热启动Taq酶可以正常保存至-20℃。

1 µL抗体（5 mg/mL）可封闭20-50 U Taq DNA聚合酶：

•  小样室温（25℃）旋转混匀孵育30 min

•  大样室温（25℃）旋转混匀孵育2~3 h

 1  双封闭抗体有效封闭Taq DNA聚合酶外切酶活性

将合成的引物探针分别配于未封闭以及双封闭抗体封闭的Taq DNA聚合酶的反应液中，40℃反应，检测两者荧光信号。

图2. 双封闭抗体外切酶活性封闭效率检测

黄色：未封闭的Taq DNA聚合酶组；紫色：双封闭抗体封闭的Taq DNA聚合酶组

由图2可以看出双封闭抗体可有效封闭Taq DNA聚合酶的外切酶活性。

 2   使用双封闭抗体分型准确，灵敏度更高

分别用翌圣生物双封闭抗体以及T公司抗体对Taq酶封闭后通过ARMS-PCR技术检测阳性样本。

图3. ARMS-PCR扩增曲线图

蓝色：T公司封闭抗体封闭；红色：翌圣双封闭抗体封闭

由图3可以看到翌圣生物双封闭抗体封闭的Taq酶在ARMS-PCR扩增中分型准确，灵敏度更高。

 3   双封闭抗体有效提升检测试剂稳定性

用传统封闭抗体与双封闭抗体分别封闭Taq DNA聚合酶，配置成含引物探针的全预混液，在4℃放置10天或在37℃放置1、3、5天，扩增10000拷贝ASFV质粒，观察扩增曲线和Ct值变化，对比传统封闭抗体和双封闭抗体对全预混反应液稳定性的作用。

图4. 传统封闭抗体(A)、双封闭抗体(B)封闭反应液扩增10000拷贝ASFV质粒扩增曲线图

蓝色：4℃放置10天；红色：4℃放置0天（对照）

由图4可以看出，双封闭抗体比传统封闭抗体更能保持反应液稳定，有效提升检测试剂稳定性。双封闭抗体封闭含引物探针全预混液4℃放置10天扩增曲线和Ct值无明显变化。

图5. 传统封闭抗体(A)、双封闭抗体(B)封闭反应液扩增10000拷贝ASFV质粒扩增曲线图

蓝色：37℃放置5天 ；绿色：37℃放置3天；黄色：37℃放置1天 ； 红色：37℃放置0天（对照）

由图5可以看出，双封闭抗体比传统封闭抗体更能保持反应液稳定，有效提升检测试剂稳定性。双封闭抗体封闭含引物探针全预混液37℃放置1、3、5天Ct值差小于0.2。

 4   双封闭抗体帮助解决基线上漂问题

某些引物配合特定buffer和仪器时，会出现基线上漂的情况。翌圣生物尝试多种方法改善基线问题，发现双封闭抗体更有利于基线平稳。

图6. N基因(A)、ACT基因(B)扩增曲线图

红色：传统封闭抗体封闭；绿色：双封闭抗体封闭

由图6可以看出特定引物和buffer下，使用双封闭抗体可帮助解决基线上漂问题。

 5   使用双封闭抗体获得良好线性

用双封闭抗体封闭的反应液扩增100000、10000、1000、100拷贝ASFV/ACT双质粒，制作标准曲线。

图7. 双封闭反应液制作ASFV基因(A)、ACT基因(B)标准曲线图

由图7可以看到，ASFV基因标准曲线R²为0.998，扩增效率为98.848%；ACT基因标准曲线R²为0.998，扩增效率为98.113%，两者线性均良好，且均无非特异性扩增。

 6   双封闭抗体可快速释放酶活

分别用进口T公司抗体和翌圣生物双封闭抗体封闭Taq酶，并在95℃下热激20 s，检测酶活。可以看到95℃热激 20 s后，翌圣生物双封闭抗体可释放95%以上的酶活，与T公司抗体相当。

 7   双封闭抗体可封闭多种类型Taq酶

用翌圣生物双封闭抗体（Cat#31303）分别封闭三种类型Taq酶（野生型+2种突变型），封闭比例为1μg：5U，测量荧光值以及封闭效率。可以看到，对于不同类型的Taq酶，翌圣生物双封闭抗体（Cat#31303）封闭效果均较好。

 8   Yeasen双封闭抗体无小鼠基因组残留

以水为模板作为阴性对照，小鼠基因组为模板作为阳性对照，扩增不同批次的31303，观察条带，发现样品未扩增出目的片段，说明抗体不存在小鼠基因组残留。

图8. 小鼠基因组残留检测图

注：-为阴性对照，+为阳性对照，1-5为31303不同批次样品

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