来宝网 2021/8/22点击1258次
DNA聚合酶的选择是聚合酶链反应(PCR)中的重要决策之一，相较于准确度需求较低的菌落PCR等分析实验，蛋白表达、突变检测、基因筛选等准确度要求较高的实验，则需要选择高保真DNA聚合酶，以保证扩增过程中的保真度。 什么是DNA聚合酶的保真度 错配率是高保真DNA聚合酶保真性的一个通用标准，错配率越低保真性越好。保真度常用错配率的倒数表示（保真度=1/错配率）。 如何测定DNA聚合酶的保真度 常见的DNA聚合酶测定方法有蓝白斑筛选测定、一代测序和NGS测序等。 ◎ 蓝白斑筛选测定 原理：利用DNA聚合酶扩增lacZ基因，基于lacZ基因的α-互补性，它能还原β-半乳糖苷酶基因活性，并产生蓝色菌落，结合蓝白斑筛选评估保真度。 操作步骤：用DNA聚合酶扩增lacZ基因，将PCR产物连接到载体上，转化，蓝白斑筛选。若lacZ基因存在错误，则破坏β-半乳糖苷酶活性，菌落呈现白色，白斑克隆的比例可转化为错误掺入的数量。 操作步骤：根据DNA模板设计PCR扩增引物；利用DNA聚合酶进行PCR扩增；将PCR产物克隆至载体上，挑取单菌落进行大规模Sanger测序，计算发生错配的核苷酸数与聚合的总核苷酸数的比值（错配率）。 ◎ NGS测序 操作步骤：根据DNA模板设计PCR扩增引物；利用DNA聚合酶进行PCR扩增；将PCR产物利用NGS平台对DNA分子进行双向测定，筛选正反两个方向均有效的数据，在突变的判定过程中，正反两个方向均测定出突变的位置记为一次突变，此突变属于DNA聚合酶引入的突变；如测定只有一个方向测定出现突变，另一个方向测定无突变，则该突变为测序平台引入的突变，不属于DNA聚合酶扩增引入的突变，计算DNA聚合酶扩增过程中引入的突变/有效DNA测序量（保真度）[1]。 提示：在PCR扩增中，不同的序列引入突变的概率是有差异的，一般研究人员选择为多个扩增产物进行测序比较，扩增的目的基因序列在设置在容易导入基因突变的富含GC 序列区域以及重复等区域。 精品推荐 翌圣生物Hieff Canace® Gold 高保真DNA聚合酶通过蓝白斑筛选测定方法，测定其保真性是Taq酶的52倍，Pfu酶的6倍。 Canace® Gold 高保真DNA聚合酶除了保真性能外，还有延伸速度快、灵敏度高、适用性广等特点。 延伸速度可达15sec/kb,极速可达1sec/kb 灵敏度高,可扩增低至1pg模板 适用于不同GC含量片段的扩增 订购信息 产品名称 货号 规格 10148ES60/80 100 U/500 U 10149ES03/08 1 mL/5×1 mL ▲ 点击产品名称查看产品详情 参考文献： [1] 王金. 一种检测DNA聚合酶保真度的方法:, CN106701896A[P]. 2017. 好啦！以上就是本期分享的内容啦！如果您刚好有扩增实验，可以按照以下流程申请试用哦！ “高保真酶”
DNA聚合酶的保真度指的是其进行准确扩增模板的能力，确保DNA序列的高度准确扩增。高保真酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，可对聚合反应时错配的碱基进行切除，从而保证扩增的准确性。
图1. 高保真酶作用原理图（源于网络）
高保真酶检测方法有很多，不同品牌的高保真酶的测定方法不同，一般保真性测定会是相对于Taq DNA聚合酶比较，来判断DNA聚合酶的保真性。
图2. Hieff Canace® Gold 高保真DNA聚合酶的保真性是Taq酶的52倍，pfu酶的6倍。
图3. Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶分别扩增小鼠gDNA 2 kb和水稻gDNA 3 kb片段。不同延伸速度（1-60 sec/kb）都可有效扩增。M：1kb DNA Marker。
图4. Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶扩增质粒3 kb片段，不同模板量（1 pg-0.5 μg）都可有效扩增。NC：阴性对照。M：1kb DNA Marker。
图5. Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶对不同GC含量（30-70%）片段都可高效率的进行扩增。M：1kb DNA Marker。
