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手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:1.1提取高品质RNA

来宝网 2021/8/7点击1118次

手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:1.1提取高品质RNA


RNA提取是RT-qPCR实验成功的首要步骤,RNA的质量直接关乎RT-qPCR实验的结果。但是在实验过程中我们经常会碰到RNA提取实验翻车的情况,主要是因为RNA的分子结构不稳定和无处不在的RNase对RNA的降解造成的。


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由此可见,想要提取到高质量的RNA并非易事。今天,小翌主要从样本选择、样本采集与保存、RNA提取这三个方面来阐述RNA提取过程需注意的关键要点,以辅助后续的qPCR实验顺利进行。


样本的选择




样本最好选择处于生长旺盛期的新鲜细胞,新鲜、生长旺盛的动物组织,新鲜幼嫩的植物组织。


样本采集和保存




»  快速处理:获取样本后,最好立即提取RNA,或者在液氮中速冻样本≥1h,之后冻存于-80℃冰箱。
注:液氮速冻需确保组织块足够小,在浸入液氮后几乎立即冻结,以确保RNase瞬间失活,稳定样本中的RNA。
    
»  RNA稳定液处理:若采样不方便携带液氮,可将样本放入RNA稳定液中,迅速渗入组织,灭活内源RNase,以稳定和保护样本中的RNA。建议组织样本大小<0.5 cm,保证RNA稳定液可渗透到组织内部。一般4℃保存过夜,之后冻存至-80℃冰箱。 (翌圣动植物组织RNA稳定液,持久保护组织RNA完好无缺,点击可产看产品详情→10604ES60


注:Trizol为裂解液,可用于保存细胞,但不适用于组织样本保存。当细胞存放在Trizol中需注明每管的细胞数量。


其他Tips




» 避免环境中RNase的污染
1)实验台面最起码要用75%的酒精擦拭干净,操作过程中应佩带口罩、手套和帽子等;
2)研钵等器具应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间;枪头和离心管等耗材要用 DEPC处理或购买RNase-free耗材;

» 避免试剂中RNase的污染
提取过程中用到的水/缓冲液要确保是RNase-free的。

» 提取RNA的过程需去除gDNA,避免其对后续RT-qPCR实验的影响

» 根据样本和实验需求,选择合适的RNA提取方法

常见的RNA提取方法




1.   沉淀法

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»
 
原理

Trizol中含有苯酚、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇,可裂解样本释放核酸,并抑制RNase活性。加入氯仿离心分层,收集上清,经异丙醇沉淀得到总RNA


» 特点
得率高,样本适用性广泛,但是纯度相对较低

» 推荐货号

Trieasy (货号:10606)



2.  离心柱法


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» 原理

高盐吸附、低盐洗脱


» 特点
得率高 ,样本适用性广泛,但是纯度相对较低

» 推荐货号

培养细胞RNA提取试剂盒(货号:19231
组织/细胞RNA提取试剂盒
货号:19221
多糖多酚植物RNA提取试剂盒
货号:19292




此,给大家介绍一款11min即可完成培养细胞RNA提取的的柱式提取试剂盒:培养细胞RNA提取试剂盒(Cat No.19231)

» 产品特点:


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» 案例展示:

使用培养细胞RNA提取试剂盒(Cat No.19231)和O品牌常规细胞/组织RNA提取试剂盒各提取2份293T细胞(10^6个细胞)的总RNA。结果显示,该试剂盒提取到的目标RNA产量一致,但纯度更高,如表1和图2。


表1. Nanodrop测定RNA浓度

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备注:Y1Y2代表培养细胞RNA提取试剂盒(Cat No.19231);O1,O2代表O品牌常规细胞/组织RNA提取试剂盒


006.png▲ 2a.hGAPDH扩增结果

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▲ 2b.hBC6扩增结果


2. 培养细胞RNA提取试剂盒的定量结果与O品牌基本一致1 μL洗脱液反转录,以cDNA10倍稀释液为模板,定量测试 hGAPDH  和 hBC6  2个基因


综上,小翌从样本选择、样本采集与保存、RNA提取这三个方面阐述了提取高质量RNA的关键要点,下期小翌将讲解RNA质量评估以及RNA降解对qPCR实验结果的影响等方面的内容,我们下期不见不散~

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