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文库“特异”决策者——接头奥秘的揭示

近些年来，测序仪型号更迭，不断刷新测序通量的纪录。测序通量的大幅增加，意味着更多的样本需要混合上机，这样的话，我们如何在茫茫数据中找到对应样本匹配的数据呢？人们想到了一种文库构建时在接头上添加“接头暗号”的方法，在测序完成之后根据“接头暗号”对样本进行分离。这里的接头暗号就是样本标签“Index/Barcode”。本文以illumina接头展开讲解，MGI接头下回见分晓。

接头概述

接头的本质是一段短的碱基序列，基本包括三个部分：与flow-cell上面寡核苷酸相同或互补的片段P5/P7；测序时测序引物结合部分R1/R2；用于区分不同样本的Index。接头是待测DNA片段与Flow-cell连接的桥梁，目的片段连接接头后可以在flow-cell上扩增再测序。

接头分类

接头的分类方法主要有两种，一是按照Index的位置，二是按照否匹配PCR-free建库。

1. 根据Index位置可以将接头分为单端Index接头和双端Index接头。单端Index接头指的是仅在P5端或P7端存在Index（一般在P7端），双端Index接头指的在P5和P7端均存在Index。Index的数目直接影响最终上机能混合的样本数目，双端Index比单端Index能容纳更多数目的样本，近年来为了满足一次能测量更多的样本的需求，双端带Index的接头被广泛使用。

2. 根据接头是否匹配PCR-free建库可以将接头分为长接头和短接头。长接头又称为完整接头，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2，完整接头通过TA克隆的方式连接到DNA片段之后，可不进行PCR扩增反应直接上机测序（DNA量足够上机测序时可直接上机，当DNA量不够时还需进行PCR扩增使得产物达到一定的量方可上机测序）。短接头通过TA克隆方式连接到DNA片段上后，必须与包含P5/P7和Index序列的引物进行PCR扩增，扩增产物才是包含完整接头的DNA片段。也就是说短接头最终一定要通过PCR扩增形成完整接头才能上机测序。

UDI、UMI接头拓展

测序过程中，为了增加上样通量，一般在面临大量样本同时测序时，会选择双端Index。目前常用的双端Index策略是将少数几种Index排列组合，最终实现更多样本的区分，但这种方式一直存在接头交叉污染的可能，常规的双端Index组合标记的文库分子，有1%的错误分配率是无法被识别剔除的。

Illumina为了进一步提升通量与扩增效率，降低测序成本，为Novaseq等高通量型测序仪引入了阵列式流动槽（PFCT）和排他性扩增（ExAmp）成簇技术，但无意间却放大了Index hopping的样本标签错配现象。

为了弥补HiSeq3000/4000、HiSeq X Series及NovaSeq等测序平台凸显的标签跳跃问题，Illumina提出在文库的两端都带上独特标签（UDI）的策略，可以进行双侧校验，剔除标签错配的接头。采用双端唯一Index分析数据时，可以将Index错误分配率降低到0.01%，与之前常规的Index排列组合方法对比，Index hopping降低了两个数量级。

此外，在低频和极低频突变检测中，避免假阳性是液体活检格外关注的重要一环。应用分子标签UMI技术（其作用是冻结DNA片段扩增前的状态），生信人员就能区分不同来源的DNA模板，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正携带的突变，从而过滤掉背景噪音，实现低频和极低频突变的准确检测。

UMI接头包含P5 Index、P7 Index和UMI元件，其中，UMI分子标签可以设计为完全随机的核苷酸链、部分简并核苷酸链或者固定核苷酸链。根据UMI标签所在的位置，又可以将UMI接头分为单端UMI（10 nt）接头（UMI标签紧随P7端Index）和双端UMI（5-8 nt）接头（UMI标签位于插入片段两端）。

Index互补Yes or No？

Illumina接头根据接头设计的长短、下游应用和建库操作不同，分为短接头和长接头。其中，采用短接头测序时，i7 Index不分测序平台，都需要反向互补，i5 Index需要根据选择的测序平台决定是否需要反向互补（Miniseq，Nextseq，Hiseq 3000/4000，Hiseq X等平台需要反向互补）。采用长接头测序时，i7 Index在任何测序平台都不需要反向互补，i5 Index反向互补与否同短接头i5 Index保持一致。

表1：接头Index测序方向汇总

如上所述，Illumina平台接头包括长接头、短接头、UDI接头和UMI接头。在文库构建过程中，接头发挥着至关重要的作用，既决定了文库的完整性，又决定了文库的特异性，接头Index作为样本的“身份证”，可区分不同来源的DNA模板，1对1的编号，既满足多样本的协同操作，也便于生信后期对下机数据进行拆分。

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