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聚焦细胞免疫疗法，您上车（CAＲ）了吗？

前言：免疫疗法是目前肿瘤治疗领域最具前景的发展方向之一，越来越多的研究靶点进入CAR-T疗法的临床实验。但这类细胞疗法在部分患者中疗效短暂、无法应对实体瘤等问题依然困扰着科学家们。要实现CAR-T细胞更广泛的治疗应用，就必须在多个层面进行设计和控制，进而提高疗效和安全性。

一、什么是CAR-T疗法？

CAR-T(Chimeric antigen receptor T cell)疗法：是指通过基因改造技术，使患者 T 淋巴细胞表达嵌合抗原受体，进而能特异性识别、结合肿瘤相关抗原靶点，并同时激活 T 淋巴细胞使其大量增殖活化，从而达到有效杀伤肿瘤细胞的效果，还可形成免疫记忆T细胞，从而获得特异性的抗肿瘤长效机制。

CAR-T的结构

CAR的结构包括胞外区、铰链区、跨膜区和胞内信号肽区。胞外区主要是抗原特异性单克隆抗体单链可变区序列，包括重链可变区和轻链可变区，二者以铰链连接。其主要作用是以非MHC（Major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体）限制性的方式特异性识别靶细胞/肿瘤细胞表面的抗原，向胞内传递T细胞活化信号。铰链区使得嵌合抗原受体更加灵活，促进抗原受体与肿瘤抗原的结合；跨膜区是CD4、CD8、CD28等跨膜蛋白分子，起到辅助传递T细胞活化信号的作用；胞内信号肽区主要是Ｔ细胞受TCR/CD3ζ 链，负责向胞内传递第一活化信号。活化的 T细胞大量增殖，并通过分泌颗粒酶、穿孔素、IFN-γ 和 TNF-α等细胞因子直接杀伤靶点肿瘤细胞。

（图源：CAR-T design: Elements and their synergistic function）

二、CAR-T疗法的技术演变

第一代CAR

1989年，以色利化学家和免疫学家Zelig Eshhar和他的团队设计出了第 一个 CAR-T细胞。第一代的CAR胞内只有CD3ζ，在细胞扩增、体内存活时间、以及细胞因子分泌等方面能力有限，使用率比较低，在肿瘤细胞的治疗中的效果并不好。

第二代CAR

2002 年，纪念斯隆·凯特琳癌症中心的Michel Sadelain团队，在CAR结构中引入了CD28共刺激因子，对提高初始T细胞获得持久的体外增殖和较强的细胞因子分泌起到了很好的效果，在临床试验中显著改善了CAR-T免疫活性激活的问题，并提高了其作用持久性。2004年，共刺激因子4-1BB被发现也能起到激活T细胞的作用。第二代CAR在目前的研究中运用最广泛。

第三代CAR

2012年，研究者们在CAR结构中引入2个共刺激因子，相比于第二代CAR来说，第三代CAR在一些前临床试验数据中表现出更强更持久的作用活性，但也有报道指出，三代CAR可能会造成T细胞刺激阈值的降低，引起信号泄露，可能诱发细胞因子过量释放。

第四代CAR

四代CAR-T细胞又被称为TRUCK T细胞 ( T-cells redirected for universal cytokine killing )，其在CAR-T细胞中引入了一个细胞因子（主要是IL-12），从而修饰肿瘤微环境，募集并活化其他免疫细胞进行免疫反应。

                                (图源：AACR)

三、CAＲ-T疗法的治疗流程

1）细胞分离：血细胞分离机采集肿瘤患者血液中的单个核细胞（PBMC）；

2）T细胞的激活：冷链运输到GMP标准的细胞实验室内分离并激活PBMC中的T细胞；

3）基因修饰：构建携带CAR的慢病毒载体，转入T细胞中，继续培养扩增至治疗所需剂量；

4）质量检测：CAR-T细胞经检测合格后，冷链运输到医院通过静脉回输至患者体内；

5）监控：观察疗效并严密监测不良反应，整个疗程持续3个星期左右。

(图源：AACR)

四、影响CAＲ-T临床疗效的因素

虽然CAR-T疗法已取得一定进步，但在体内增殖、持续性、肿瘤识别和杀伤能力、安全性与克服副作用等方面，还需要持续完善。

1、CAＲ的分子结构设计

共刺激分子胞内区的嵌入的功能区会影响CAＲ-T的体内活性和持续性。研究表明在CAＲ结构中嵌入CD28能显著改善一代CAＲ-T在B细胞淋巴瘤患者体内的扩增和持续性。目前已有CD28、CD137、CD134、ICOS 和DAP10等多种共刺激

分子的胞内区用于二代CAＲ的研究^[1]。

图A  T细胞受体的结构：由异源二聚体形式的抗原特异性α和β链组成，α和β链与CD3复合体的ε､δ､γ和ζ链紧密相连。T细胞受体与HLA结合。

图B  CAR：包括与肿瘤抗原结合的单链可变片段（scFv）和细胞内的共刺激结构域，如CD28和4-1BB以及CD3ζ链，它们驱动信号激活和CAR T细胞扩增。

（图源：Longo D L , June C H , Michel S . Chimeric Antigen Receptor Therapy[J]. New England Journal of Medicine, 2018, 379(1):64-73.）

2、载体系统的选择

CAR的载体系统可以使用质粒、γ-逆转录病毒或慢病毒等。应用于制备CAR-T细胞的质粒或病毒都必须经过鉴别试验、复制型病毒检测、无菌试验、内毒素检测、支原体检测、相关添加成分的残留量检测、病毒滴度测定以及效力试验^[2]。

不同载体系统的比较^[3]：

五、CAＲ-T疗法的优势和局限性

1、CAＲ-T疗法的优势

1）无MHC限制性

2）可识别的抗原种类多

3）可以在体内继续增殖

2、CAR-T疗法的局限性

1）毒副作用

2）血液肿瘤可能复发，实体瘤治疗效果差

3）制备费用高，难以产业化

六、CAR-T疗法未来的研究方向

基于CAR-T治疗暴露出的局限性，目前有关CAR-T的研究和开发，主要围绕自杀开关，消除标记，药理抑制和双分子CAR设计四个方向来进行，旨在降低CAR-T细胞毒性和提高CAR-T治疗的有效性^[4]。

（图源：Schmidts A , Wehrli M , Maus M V . Toward Better Understanding and Management of CAR-T Cell–Associated Toxicity[J]. Annual Review of Medicine, 2021, 72(1).）

参考文献：

[1]Longo D L , June C H , Michel S . Chimeric Antigen Receptor Therapy[J]. New England Journal of Medicine, 2018, 379(1):64-73.

[2]中国医药生物技术协会《嵌合抗原受体修饰 T 细胞（CAR-T细胞）制剂制备质量管理规范》

[3]唐晓义, 陈虎, 张斌. 嵌合抗原受体修饰T细胞免疫治疗的机遇与挑战[J]. 解放军医药杂志, 2015, 000(001):12-25.

[4]Schmidts A , Wehrli M , Maus M V . Toward Better Understanding and Management of CAR-T Cell–Associated Toxicity[J]. Annual Review of Medicine, 2021, 72(1).

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