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酶切法PCR-Free建库，1h/1ng极速建库

高通量测序中，常规的文库构建需要PCR扩增，一方面，是为了对微量DNA样本进行扩增，提高文库产量，另一方面，可以放大荧光信号，让测序仪更容易捕获和识别荧光信号，提高测序准确度。但是，PCR就像一把“双刃剑”，在解决了样本起始量低的问题并起到放大荧光信号作用的同时，却也引入了扩增错误和偏向性，不能完美地呈现基因组序列“真实面貌”。因此，PCR-Free技术的引入，既具备了PCR的优势，也克服了PCR的缺点。

实验目的：

验证酶切法PCR-free建库试剂盒最低样本投入量。

实验描述：

不同来源样本，不同投入量，统一酶切12min不分选，进行PCR-free建库，使用qubit定量文库并通过2100核实文库条带分布。

结果展示：

注：由于部分接头残留，Qubit检测文库浓度最终大于样本的投入量。

注：由于Y接头结构的影响，2100不能准确分析PCR-free真实文库大小；电泳图-文库主带约在380-400bp。

图2：A5、A10、A15 PCR-free文库电泳图及A3、A8、A13 2100峰图

结论：

酶切法PCR-free建库试剂盒，样本最低投入可低至1ng。

机械法PCR-free建库试验验证

实验目的：

对照试验，实验条件与上述酶切建库一致，验证低投入量机械法建库产量与酶切法差别。

实验描述：

不同来源的样本，统一机械打断，用相同的比例分选出300bp大小的插入片段，选择投入1/5/10 ng分选产物进行PCR-free建库，使用qubit定量文库并通过2100核实文库条带分布。

结果展示：

注：由于部分接头残留，Qubit检测文库浓度最终大于样本的投入量。

注：超声分选模板-主带大小300bp，即PCR-free文库大小约420bp

图3：超声分选模板2100峰图（左）及B3、B6、B9文库2100峰图（右）

结论：

机械法PCR-free建库试剂盒，1/5/10 ng投入文库产出与酶切法相近。

总  结

根据Qubit值判断，酶切法PCR-free建库高低投入量均有文库产出，且低投入量文库产出与机械法PCR-free建库相当。文库2100峰图显示PCR-free文库有微量接头残留，实验时接头用量需根据实际情况进行调整。（注：实际样本操作时，建议选用qPCR文库定量，可更直观显示有效文库产量）

由上述两个实验可以看出，酶切法PCR-free建库低投入量实验完全可以达到机械法建库的效果，而且建库流程精简，无需复杂的机械片段化过程，一步完成片段化/末端修复/加A ，1h即可完成整体的建库流程，是目前快速建库的不二之选。

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