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转染效率低？小翊手把手教你做转染实验

细胞膜是由磷脂双分子层和镶嵌蛋白组成的，带有负电荷。因此带有负电荷的DNA或RNA无法通过细胞膜。为了让核酸（DNA或RNA）通过细胞膜，研究人员利用不同的方法，包括使用化学物质和包被核酸的载体分子进行中和，以及在细胞膜上开孔等物理方法，将核酸（DNA或RNA）直接运输到细胞内。这些就是转染的过程，转染的目的是促进蛋白合成，调节基因表达，促进细胞生长与发育等，目前越来越多地被用到功能研究中。

图1 DNA/RNA转染过程（图片来源：图片来源于网络）

1.常见转染方法

根据导入的核酸在目的细胞中存活时间的长短，可以将转染技术分为瞬时转染和稳定转染。也可以根据转染方式的不同，分为化学转染，物理转染、和生物转染方法。例如脂质体转染、阳离子聚合物PEI转染、电转、显微注射、以及慢病毒包装转染等等。

但是，没有一种转染试剂可以满足所有的实验要求。必须根据您的细胞类型（原代细胞、贴壁细胞、悬浮细胞）、外源核酸种类（DNA、RNA）、基因表达时间、细胞毒性、转染效率等，操作是否简便等因素，挑选出最理想的转染试剂。

图2不同转染方法的原理和优点

在转染过程中，即使选对了合适的转染试剂，还是不可避免会出现各种令人头疼的问题，例如，转染效率低，细胞死亡，重复性差等问题。对于这些问题，我们接下来会详细剖析。

2.转染效率低

2.1转染前

1）核酸纯度不够，比如DNA/RNA不纯、质粒中含有内毒素、核酸不完整、核酸浓度过低均会导致转染效率低。建议使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率。

2）要检测所用的无血清培养基与转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 与转染试剂不相容。

3）用了含有血清的培养基制备转染复合物。血清会降低复合物的形成。建议用无血清培养基稀释DNA/RNA和转染试剂。

4）DNA或RNA的复合物形成的比例，一般DNA（µg）：转染试剂（µL）=1:2~1:3；而RNA（ng）：转染试剂（µL）=9:1~3:1。

5）复合物孵育时间过短，未能充分形成复合物。建议复合物孵育时间10~20 min。

6）转染试剂保存不当，降低转染效率。保存在4 ºC冰箱，不可冻存，避免反复长时间开盖。

2.2转染时

7）细胞密度过低或过高。DNA转染细胞密度90%~95%，RNA转染细胞密度30%~50%。

8）细胞生长状态不佳。清除支原体、真菌、细菌等污染，保证提供新鲜的生长培养基。

9）转染时细胞上清液中含有抗生素、生长因子等，大大降低转染效率。

2.3转染后

10) 转染时间过短。一般质粒表达水平在24~48h，mRNA表达水平在24~72 h，蛋白表达水平在48~96 h。

3.细胞毒性大

3.1转染前

1）核酸纯度不纯也会造成细胞毒性。要确保质粒中无内毒素，使用高纯度的DNA或RNA会降低细胞毒性。

2）转染试剂过量。优化转染试剂的用量，以及优化复合物的比例。

3）要检查稀释复合物的培养基与细胞的相容性，已知DMEM培养基对一些昆虫细胞系有毒性。建议选择合适的培养基。

3.2转染时

4）细胞密度过低，会导致部分细胞死亡。DNA转染细胞密度90%~95%，RNA转染细胞密度30%-50%。

5）细胞生长状态不佳。清除支原体、真菌、细菌等污染，保证提供新鲜的生长培养基。

3.3转染后

6）转染后目的蛋白的过度表达对细胞产生毒性。建议及时更换新鲜培养基，或者添加一些营养物质。

7）转染后表达蛋白对细胞产生毒性。建议换一种细胞系重新转染。

8）转染时间过短，就进行抗性筛选。一般质粒表达水平在24~48h，mRNA表达水平在24~72 h，蛋白表达水平在48~96 h。

9）抗性筛选时，加入的抗生素浓度过高。适当降低抗生素的浓度。

4.重复性差

4.1转染前

1）移液误差。将DNA/RNA和转染试剂充分打匀后，用移液器缓慢均匀的吸取，避免产生误差。

2）制备复合物时，未充分混匀。将DNA/RNA和转染试剂轻轻混匀，并保证相同的孵育时间。

4.2转染时

3）细胞密度存在差异。一般在特定的密度范围内，细胞密度越低，转染效率越低，相反越高。

4）细胞生长状态存在差异。好的细胞状态，转染效率越高。

5）细胞传代次数不同。对于多次传代的细胞，细胞的基因组和表型都会发生变化，不建议使用传代次数过多的细胞进行转染实验。

4.3转染后

6）转染时间不一致，表达的蛋白水平会有差异。

5.相关文献及产品

已发表文章

[1] Chen T, Chen Y, Chen H, et al. Dual-enzyme-propelled unbounded DNA walking nanomachine for intracellular imaging of lowly expressed microRNA[J]. Nano Research, 2019, 12(5): 1055-1060. （IF 8.21）

[2] Zhang X, Qi Z, Yin H, et al. Interaction between p53 and Ras signaling controls cisplatin resistance via HDAC4-and HIF-1α-mediated regulation of apoptosis and autophagy[J]. Theranostics, 2019, 9(4): 1096.  (IF 8.12)

[3] Zhang K, Zhao X, et al. Enhanced Therapeutic Effects of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes with an Injectable Hydrogel for Hindlimb Ischemia Treatment. ACS Appl Mater Interfaces. 2018 Sep 12;10(36):30081-30091.（IF 8.09）

[4] Chen Y, Hao Q, Wang J, et al. Ubiquitin ligase TRIM71 suppresses ovarian tumorigenesis by degrading mutant p53[J]. Cell Death and Disease, 2019, 10(10): 1-14. (IF 5.72)

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