来宝网 2020/8/31点击1234次
靶标伴“His”，蛋白纯化明明白白！
蛋白纯化简介
蛋白纯化是将目标蛋白从实验样本的总蛋白中分离出来，同时仍保留目的蛋白的生物学活性及化学完整性。在构建载体阶段，除了一些必要的表达元件，还需要考虑的密码子优化以及标签的选择。选择合适的标签不但有利于蛋白的纯化，促进蛋白的可溶性，同时也不能影响蛋白的结构功能和下游应用。以下简单列举几个常见蛋白标签：
表1 不同蛋白纯化标签介绍
标签 | 大小kDa | 序列 | 纯化效价 | 标签切除 |
HIS标签 | ~0.84 | HHHHHH | + | TEV蛋白酶 |
GST | 26 | + | 3C蛋白酶/PSP | |
MBP | 42 | + | Factor Xa、EK | |
FLAG | 1.01 | DYKDDDDK | + | EK |
V5 | ~1.5 | GKPIPNPLLGLDST | ||
Myc标签 | 1.2 | EQKLISEEDL | ||
HA标签 | 1.1 | YPYDVPDYA |
浓缩的精华，纯化的领头羊
His-Tag 为何会逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。其主要优势在于：
高序列兼容性：N-端的His-tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；
小序列影响小：His-tag非常小，His-tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能；且在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；
免疫原性低：His-tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；
联合使用性强：与其他的亲和标签构建成亲和标签，并可用于多种表达系统，纯化的条件温和；
适用范围广：his标签融合蛋白的适用范围也较广，即可用在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白，而后者则通常纯化包涵体蛋白。
因此，His逐渐成为了蛋白纯化的首选标签。
Yeasen His纯化树脂生产工艺
Yeasen生物自主研发的HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，与Ni-IDA树脂相比，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可或缺的树脂之一
图1 His树脂的产品原理图
产品特性
图2 His树脂的产品特性
蛋白纯化流程图
1）装柱：将HisSep Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化重力柱中；
2）清洗：3-5倍柱体积去离子水冲洗重力柱；
3）平衡：至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡含有填料的重力柱；
4）上样：注意控制加样速度，耐压0.1 MPa，流速控制在10滴/min，确保目的蛋白与Ni2+充分接触，以提高纯化得率；
5）洗杂，低浓度咪唑的缓冲液进行洗杂；
6）洗脱：使用5-10倍柱料体积Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即目的蛋白溶液。
图2 His 蛋白纯化简易流程图
HisSep Ni-NTA Agarose Resin测试数据
测试产品：
1、某知名品牌his纯化产品；
2、大量生产的FF高流速产品；
3、小样生产的FF高流速产品；
4、本次生产的普通级别的his树脂（20502ES）；
缓冲液：各个处理组均为1ml树脂纯化200 ml菌液；洗杂使用25mM的咪唑，洗脱液为250mM的咪唑。
测试报告一：His纯化树脂结合效率测试，与市场知名品牌进行对比，Yeasen研发的20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin （4号）具有良好的结合效率。如下图：
图3 His纯化树脂结合效率测试
测试报告二：以常利用的变性剂尿素为例，分别进行了不同产品在8M尿素下耐受性测试， 20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin （4号）对尿素的耐受良好，与市场知名品牌无差异。如下图：
图4 His树脂对8M尿素耐受性测试
测试报告三：对于20502ES HisSep Ni-NTA Agarose Resin（4号）进行了批次检测稳定性测试，从结果看批次间差异基本控制在5%以内，以保证更好的稳定性。如下图：
图5 His纯化树脂的批次间比较
FAQ
常见问题 | 原因 | 优化建议 |
洗脱组分中无目的蛋白 | 蛋白可能是包涵体 | 可通过电泳检测裂解液，分析上清中是否有目的蛋白，包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式 |
表达量太低 | 优化表达条件，使用包涵体纯化缓冲体系 | |
目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤中已被洗下来 | 提高Wash Buffer的pH值，或者降低咪唑浓度 | |
目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来 | 降低Elution Buffer的pH，或者增加Elution Buffer中的咪唑浓度；使用10-100 mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到蛋白 | |
洗脱组分不纯（含多种蛋白） | 洗杂不彻底 | 增加Wash Buffer 体积 |
样品中含有其他His标签蛋白 | 通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段（如去离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。 |
相关产品
产品名称 | 货号 | 规格（mL） |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂） | 20502ES10/50/60/80 | 10/50/100/1000 |
HisSep Ni-NTA Agarose Resin 6FF （His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂） | 20503ES10/50/60/80 | 10/50/100/1000 |
HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5mL （His标签蛋白纯化预装柱，5 mL） | 20504ES08/25 | 5/5×5 |
HisSep Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 1mL（His标签蛋白纯化预装柱，1 mL） | 20505ES03/08 | 1/1×5 |
Anti-His Affinity Gel（Anti-His标签亲和纯化凝胶） | 20589ES03/08/25/60 | 1/5/25/100 |
Imidazole咪唑 | 20501ES60/76 | 100 g/500g |
经典文章分享：一文书纸，教您如何使用树脂和预装柱纯化产品！https://mp.weixin.qq.com/s/5nImcKzhilNtUWy3cPscaQ
