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PCR-Free建库，你get到了吗？

高通量测序中，常规的文库构建需要PCR扩增，一方面，是为了对微量DNA样本进行扩增，提高文库产量，另一方面，可以放大荧光信号，让测序仪更容易捕获和识别荧光信号，提高测序准确度。但是，PCR就像一把“双刃剑”，在解决了样本起始量低的问题并起到放大荧光信号作用的同时，却也引入了扩增错误和偏向性，不能完美地呈现基因组序列“真实面貌”。因此，PCR-Free技术的引入，既具备了PCR的优势，也克服了PCR的缺点。

什么是PCR-Free技术？

常规NGS文库构建的核心步骤为：基因组打断-末端修复-加接头-PCR-测序前信号放大。那么，PCR-Free建库又是怎样的呢？顾名思义，就是不需要PCR的建库过程。其文库构建的核心步骤为：基因组打断-末端修饰-加接头-文库质控。但事实上，这只能算是建库环节的PCR-Free。真正的PCR-Free，应该是从建库到测序全流程均无文库扩增的过程（例如单分子测序技术）或者无PCR扩增错误累积的测序技术（例如MGI的DNBseq）。

图1：常规建库与PCR-Free建库流程图

PCR-Free技术优势

在常规建库过程中，扩增酶存在引入错误的可能，通过循环扩增, 这些错误会被积累放大，降低了DNA序列复制的保真性。此外，DNA聚合酶还具有一定的扩增偏向性，尤其是针对GC含量差异大或者二级结构等区域，扩增效率低，覆盖均一性差；在引入错误InDel的同时，还会带来大量的Duplication，造成DNA数据量的浪费，增加测序成本。而PCR-Free技术则能很好地规避常规建库中因PCR扩增而引入的上述问题，具体优势如下图所示。

图2：PCR-Free技术优势

PCR-Free数据展示

1.华大平台Hieff NGS^® OnePot II DNA Library Prep Kit （Cat#13321）PCR-free建库，相同投入量，不同的打断时间，均能获得良好的纯化回收率和环化效率。具体数据如下表：

表1：MGI平台PCR-Free建库数据

2.Illumina平台Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit（Cat#12204）与En*建库试剂盒进行PCR-Free建库实验。上机测序数据结果显示：12204测序数据更佳。

表2：Illumina平台PCR-Free测序数据

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