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干货分享|酶切法DNA建库“十问实答”，助您建库无忧

第二代测序(NGS)技术迅猛发展，越来越多的科研工作者采用NGS技术作为课题研究的主要手段。NGS过程中，基因文库的质量直接影响后续的测序工作，因此构建基因文库是整个测序过程中最为关键的步骤。其中酶切法DNA文库构建，越来越多的获得广大科研人员的青睐。相信在运用酶切法构建DNA文库的过程中，大家或多或少的会遇到各种问题。

他山之石，可以攻玉！接下来小翊带领大家一起解决实验开展前后的可能遇到的各种困惑。

实验开展前，“千头万绪”

1、DNA文库构建方法的选择：为什么酶切法建库如此备受青睐？

酶切法构建DNA文库，相较于传统的超声法和转座酶法具有以下优势：

² 无偏好片段化酶：具有稳定的片段化效果，无需复杂的机械片段化过程。酶切产物片段大小同样本类型、Input DNA量和GC含量等均无相关性，仅与酶切时间有关。

² 建库流程精简：一步完成片段化/末端修复/加A ，片段化/末端修复/加A （30min）-接头连接（15min）-纯化/分选（30min）-文库扩增（15min）-纯化分选（30min），常规建库预计耗时约2h，PCR-free建库预计耗时1h。

² 宽泛的样本投入范围：相比较固定投入量，固定酶切时间的TN5建库，酶切法建库适用500 pg-1 μg，满足个性化建库。

图1.翊圣Onepot系列酶切法建库优势

2. 酶切法建库运用的是什么酶，类似限制性酶切酶吗，具体如何打断DNA呢？

不同于限制性酶切酶，片段化酶是随机内切酶，不受特定酶切位点的限制，随机切割对应模板DNA，片段化的产物属于粘性末端，后续需要进行末端修复。

举例：投入500 pg-1000 ng的正常人类基因组DNA，30 ℃ 15min, 可将DNA酶切为150-550 bp左右的长度。

3. 酶切法建库适合哪些应用研究吗，对样本具有普适性吗？

片段化酶酶切法建库可适用全基因组测序（含PCR-free文库构建）、全外显子测序、靶向捕获测序、宏基因组测序等。适合样本类型是gDNA、cDNA和高质量的FFPE样本等，不适合cfDNA（cfDNA无需打断）。

4、酶切法建库试剂盒针对哪些样本建库效果比较好？

兼容范围为500 pg – 1μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280= 1.8-2.0的高质量Input DNA。基因组DNA和cDNA均可获得高产高质的文库。

举例：

展示为翊圣onepot II系列12204应用于cDNA文库构建（ds-cDNA）

背景：客户得到逆转录的ds-cDNA，全长1.1kb左右，想酶切至300 bp左右。

结论：Input DNA 50 ng左右，酶切4-10 min，PCR 8Cycles，产量>3μg,若需要更集中的文库，可进行双轮分选。

5、对于不同类型的DNA样本，酶切时间如何控制？

对于常规的高质量基因组DNA，酶切时间如下：

当然了，为保证优质精确的片段化效果，建议在自己的实验体系中进行微调。

实验开展后，“五味陈杂”

6、gDNA片段化参考说明书酶切条件酶切20 min，竟然切不动？

一般优先考虑DNA的质量问题，比如 Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐离子，可能会影响酶切效果，建议将DNA稀释在ddH₂O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中再进行片段化。其次，如果样本是反转录得到的全长cDNA，则需考虑样本纯度问题。另外，对于环状DNA的酶切，需要另行摸索酶切时间体系。特殊样本可考虑磁珠纯化之后进行酶切或适当延长酶切时间。

备注：红色曲线表示，30度酶切20 min未切开

7、FFPE样本，酶切时间太难控制了？

众所周知，FFPE样本虽然使组织得以长期保存，但其特殊的制作方法和保存过程对核酸分子造成多方面的影响：核酸与蛋白交联、降解严重等诸多问题。我们先来看下不同质量的FFPE样本，采用相同的酶切条件影响有多大。

举例：相同酶切条件下，质量高的样本酶切效果较好，满足需求（样本4），质量差的样本出现过度酶切现象，酶切片段偏小（样本1/3）

因此对于不同降解程度的FFPE样本，建议做好质量控制，对样本进行分层级，不同层级的推荐酶切时间参考下表。对FFPE样本，建议搭配翊圣FFPE修复试剂FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606).

备注：FFPE样本DNA质量也可通过琼脂糖凝胶电泳胶图简单判断，高质量样本-DNA质量大于10kb，条带明亮单一，建议酶切10 min左右；一般质量样本-胶图显示无明显主带，整体弥散条带，建议酶切6-8 min；质量较差样本-胶图无主带，整体条带弱，建议酶切2 min；极差FFPE样本，建议可不酶切，搭配FFPE修复试剂直接建库。

8、DNA酶切后出现大片段残留？

酶切产物出现大片段残留现象，考虑Input DNA纯度外（参考FAQ 6），建议适当延长酶切时间。

9、酶切时间也不长，竟然过度酶切了?

以插入片段300 bp为例，白细胞gDNA，30 度酶切10min，出现如下图过度酶切现象。建议参考酶切条件需要考虑不同样本gDNA大小，如白细胞gDNA较小，应适当缩短酶切时间，否则易出现如下过度酶切现象。

10、酶切法建库，如何做到较好的质量控制？

1）文库浓度检测，qubit法或qPCR ；

2）文库长度检测，琼脂糖凝胶电泳测定；

3）文库质量鉴定，Agilent 2100/2200；

4）文库大小分布、引物二聚体和过扩增产物的缺失，应通过电泳方法进行确认.

构建优异的DNA文库，除了明确以上因素之外，还需要选择高质量的建库产品。翊圣生物为满足广大科研工作者的NGS建库实验需求，推出了NGS建库整体解决方案，方便大家根据实验需求进行选择。