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深度分享|如何生产高质量的IVD核心酶原料-抗体法热启动酶

新冠疫情席卷全球，分子诊断技术站了在世界的舞台中央。荧光PCR法作为新冠病毒核酸检测的金标准，为新冠病毒的检测提供有力保障，然而，检测结果不准确、假阳性和假阴性等问题，也一度让分子诊断技术备受争议。深究原因排除人为操作因素外，归根结底要考虑试剂盒的质量问题。而新冠检测过程中的核心成分--扩增模块中的热启动酶，无疑是其中最关键的一环。

市面上的诊断试剂盒扩增模块中，几乎全是抗体法热启动酶。但实际样本检测中不同厂家的酶原料又差异很大。那如何筛选出完美的抗体法热启动酶?

在这里，简单整理下抗体法热启动酶的评测指标：

² Taq酶活：Taq酶活测定目前在分子诊断行业没有固定的标准，不同厂家酶活标定的方法不同，导致客户使用中会出现较大的问题。一般测试方法是同位素的方法进行测定。这种方法具有高灵敏性，但只能检测聚合酶活性，所以有时候并不能反映出实际TaqMan探针的扩增效果。TaqMan探针法qPCR 除了需要Taq酶5’-3聚合酶活性外，还需要检测Taq酶的5’-3’外切酶活性。这就是常规Taq酶活性测定的缺陷。建议大家购买了特定公司的Taq酶之后需要用自己设计的引物探针进行实际酶活的二次标定，以减少应用中的不确定性。翊圣生物除了做Taq酶5’-3聚合酶活性检测之外，还利用TaqMan的方法进行5’-3’外切酶活性的标定，减少了客户实际应用中的问题。

² 扩增效率：PCR反应的扩增效率与DNA聚合酶的性能密切相关。通常验证扩增效率是将模板稀释成一系列浓度梯度进行qPCR反应，用模板初始量（或未知量样品的稀释倍数）的log值对每个稀释样品的Ct值，做标准曲线图，得到斜率和R²值，扩增效率通过公式E=10^-1/斜率-1可计算出扩增效率，若介于90~110%，表示扩增正常。若＜90%，则可能qPCR整个反应条件不适宜或引物设计的不当。

扩增效率与酶的比活性有较大的关系。酶的纯度越高，比活性相对就高，这样可以减少非活性Taq酶与底物的结合，提高有效扩增几率。

² 灵敏度：Taq酶的灵敏度和很多方面都有很大的关系，比如上面提到的酶纯度。另外一个方面是Taq酶和底物的亲和性，如果亲和性越高，灵敏度自然就会比较高。相比底物亲和性较低的Taq酶就需要通过提高酶浓度，即增加单次反应中的Taq酶的分子数来达到提高灵敏度的目的。这时试剂成本就会提高很多。翊圣生物通过筛选高亲和性Taq突变体，保障了个位拷贝数检出的灵敏度。

l 抗体法热启动酶：热启动Taq酶是提高PCR扩增灵敏度和特异性的最重要的因素之一。非热启动的Taq酶由于在试剂配制过程中，会有一定的活性，容易进行非特异性扩增，最终会导致灵敏度的降低。一个活性有效封闭的Taq酶对于qPCR的有效扩增至关重要。翊圣生物通过高通量筛选抗体，获得了高亲和，易释放的抗体，并开发了相关的检测方法，保障了热启动Taq酶的高品质。

熔解曲线测定性法：设置非热启动组、抗体封闭组、和无聚合酶对照组，将模板和引物对加入SYBRGreen染料法qPCR的反应体系中，37℃孵育40min，分别检测熔解曲线。非热启动组显示出有扩增产物生产，而另外两组是引物二聚体，没有产物形成。这说明抗体封闭效果明显。

l 荧光值定量法：一般通过对比非热启动组、抗体封闭组和无聚合酶对照组的荧光值高低判断封闭效果。在50 ℃ 条件下进行延伸，反应后取产物，加入适量PicoGreen染色液染色混匀后，进行荧光信号检测。根据荧光值判断热启动酶活封闭效果，进一步计算封闭效率，一般认为封闭效率大于90%即认为封闭效果良好。

表1 热启动酶抗体封闭效率检测

备注：封闭效率=100%-（样本荧光值-阴性荧光值）/（阳性荧光值-阴性荧光值）

应对新冠疫情，以上指标最关键的是热启动型DNA聚合酶的灵敏度。

 NO.1 为什么选择抗体法热启动酶作为分子诊断核心酶

热启动酶在IVD领域应用较为广泛，很好的解决了因常规型PCR技术不特异如产生引物二聚体或错配引起的非特异性扩增等问题，大大提高了反应的特异性，从而实现精准检测。在应对全球爆发的新冠疫情方面，热启动酶亦贡献颇多。目前市面上应用于SARS-Cov-2的一步法RT-qPCR检测试剂的核心酶大都是抗体法热启动酶。

为何抗体法热启动酶在临床检测方面应用如此广泛？

反观市面上常见的热启动酶，按热启动修饰方法主要分为化学法、配体法和抗体法等。但化学修饰物不能够批量合成，而且需要较长的激活时间DNA聚合酶才能释放酶活。配体修饰DNA聚合酶只在20-25°C效果较好，到40°C时，聚合酶的活性就被释放出来，即酶活封闭效果不稳定，特异性不好；而抗体修饰的热启动酶可以达到很好的封闭酶活的效果，即对应的封闭效果最佳，酶活释放速度快，是目前IVD市场上应用最多的DNA聚合酶热启动改造方法。

NO.2 如何确保抗体法热启动酶符合市场需求

生产合格的IVD试剂，一般是在原料控制、生产管理、质检管控和仓储运输几个环节严格把控，层层把关。而抗体法热启动酶作为IVD试剂的核心原料，生产高质量的抗体法热启动酶主要考虑其中两个核心组分：封闭用抗体和DNA聚合酶。因此在原料把控、生产管理、质检环节和仓储运输方面也需要慎之又慎。

Ø 原料管控：严格的原料质量管理标准，包括采购标准和保存标准。重要原料每批质检并留样保存。抗体法热启动酶的核心原料：封闭用抗体和配套的buffer离子。在原料管控方面主要注意避免引入外源性污染，而封闭抗体的筛选，在确保抗体的纯度外还需要进一步检测宿主DNA残留。

Ø 生产管理：严格按照IVD产品生产标准管理生产流程。从小样研发配制到规模化生产，稳定生产工艺，保证批次稳定性。同时严格把控包装流程。抗体法热启动酶生产时需要根据抗体纯度和DNA聚合酶的酶活，精准配比保证产品质量。

² 质检管控：产品质量控制严格遵循“三重防护”：中间原料质检，成品自检留样、成品抽检管控。抗体法热启动酶生产后的质控环节，主要在核酸酶残留检测、大肠杆菌检测、DNA扩增能力测试和抗体法热启动酶酶活封闭效果检测等方面，同时在不同批次的稳定性把控方面坚持质量问题“零容忍”。

Ø 仓储运输：遵循模块化仓储，冷链运输原则。

NO.3 翊圣生物提供IVD核心原料

翊圣生物作为长期专注于分子酶原料及建库试剂盒等产品研发和生产的国家高新技术企业，依托长期储备的分子酶双向改造技术、蛋白发酵纯化技术和高效抗体筛选技术平台，翊圣生物酶原料可应用于IVD分子诊断、治疗领域。不仅可提供

抗体法热启动酶和封闭用Taq酶抗体和Taq酶5'→3'外切酶单克隆抗体，也可提供包括RT-PCR检测试剂盒组装用的核心试剂和所需的一系列关键分子酶原料，包括抗体法Taq酶、反转录酶、RNase抑制剂和UDG酶/dUTP等。

关于翊圣生物

上海翊圣生物科技有限公司（Yeasen Biotech Co., Ltd）成立于2009年，是国家高新技术型企业，长期专注于分子酶原料及建库试剂盒等产品的研发和生产。我们的目标让下游企业节省更多的成本，为中国精准医疗的发展贡献自己的力量。翊圣生物拥有先进的分子酶双向技术平台、大规模蛋白发酵纯化技术平台、高效抗体筛选技术平台，目前已成功开发各类诊断分子酶、二代测序建库酶等40余种，并实现工业放大。翊圣生物开发的用于基因检测、体外诊断（IVD）相关酶原料获得了广大客户的认可。此外，我们还为工业客户提供定制化开发服务，以满足个性化需求。

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