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高封闭效率Taq antibody助力新冠病毒单拷贝数检测

新冠病毒的遗传物质RNA是病毒存在的直接证据，RT-PCR核酸检测技术通过特异性地检测病毒RNA被用于疾病的鉴别诊断。作为新冠病毒检测的核心手段，RT-PCR技术高频率地出现在NMPA应急审批项目和国外标准认证项目中。

和其他基于PCR和qPCR的检测反应体系一样，RT-PCR检测试剂盒中的组分包括热启动Taq DNA聚合酶、反应缓冲液、引物、模板等。其中，热启动Taq DNA聚合酶作为酶促反应的核心酶，确保整个PCR反应的进行。其热启动特性的实现多是依赖于Taq 酶抗体（Taq antibody）。Taq antibody是抗Taq DNA聚合酶（简称Taq酶）的抗体，与Taq酶结合后可抑制DNA聚合酶活性。

图1. Taq antibody高温快速失活，释放Taq DNA聚合酶活性

Taq antibody通过封闭DNA聚合酶活性减少非特异性扩增

以我们常用的Taq酶为例，Taq酶的聚合酶活性最适温度是72℃，但是它在20℃-37℃下也具有一定聚合酶活性^[1]，在室温下配置反应体系或反应升温的时候，容易形成引物非特异性退火及引物二聚体，此时发生聚合反应，就会引起非特异性扩增。一种减少非特异性扩增的手段是在更低聚合酶活性温度下如冰上配制PCR反应体系。

另一种考量是如果我们用Taq antibody把Taq酶的聚合酶活性暂时封闭，使其在低温时处于无活性状态，在PCR预变性95℃加热时，Taq antibody变性，解除封闭，Taq酶再现活性，就可以避免错配或引物二聚体引起非特异性扩增。

Taq antibody可提高新冠病毒核酸检测试剂盒的检测灵敏度

另外一个考虑因素在于试剂盒的检测下限，即检测灵敏度。通过业内人士了解到，新冠检测试剂盒中的RT-PCR检测试剂优化方向是保证体系中单分子拷贝数检测的灵敏度。非特异性扩增的存在（可以理解为“引物噪音”）是PCR反应的主要障碍，它会通过消耗引物和Taq酶而显著降低目的基因扩增的灵敏度。

针对低丰度基因，抗体封闭一方面可以避免95℃预变性前的DNA聚合酶和模板的非特异性结合，提升PCR反应过程中DNA聚合酶的使用效率（使用效率可以理解为与正确模板结合），另一方面抗体封闭后，95℃预变性，DNA解链（释放出正确的引物退火位点），热启动形式增加了引物与微量的正确模板碰撞退火的效率。以上有效提升良好的引物扩增效率，保证低丰度基因有效检出。总之，抗体封闭热启动Taq酶可减少引物非特异性退火及引物二聚体的聚合反应的背景噪音信号，通过维持相对“纯净”的引物和模板等有效退火环境，有效提升灵敏度和扩增效率。

Taq antibody封闭Taq酶效果展示

我们可以做一个对比，来看看Taq antibody是怎样抑制非特异性扩增的。

设置抗体封闭组（融合比例是1U Taq酶/0.1μg Taq antibody）和无抗体封闭组，将部分互补的引物对加入qPCR的反应体系中，37℃孵育40min，分别检测产物荧光值，如表1。荧光值增高则表示发生了聚合反应。

表1 热启动抗体封闭效果

该抗体封闭组加入了翊圣生物的Taq酶单克隆抗体（Cat#31301ES），可以看到无抗体封闭组荧光值增高，表明Taq酶在37℃发生了聚合反应，而Taq酶单克隆抗体可以有效封闭聚合酶活性，由此可以抑制非特异性扩增。

图2. 热启动抗体封闭效果熔解曲线

我们将上述产物生成熔解曲线（图1），可以看到Taq酶单克隆抗体有效封闭聚合酶活性，产物片段大小与无聚合酶对照组一致，而无抗体封闭组明显发生了聚合反应。

热启动封闭抗体选择的认知局限

在选择热启动封闭抗体的时候，有些问题需要了解：

误区1：热启动封闭抗体的好坏取决于抗体的亲和力

按照我们以往的认知，认为抗体有足够亲和力才能与DNA聚合酶结合，才能有效封闭。其实抗体结合于DNA聚合酶的活性封闭位点是有差异的，如果不能结合在有效阻断聚合酶活性的位点上，亲和力再高也是无用的。所以热启动封闭抗体结合位点非常重要，一个优质的热启动封闭抗体，应该能准确的结合活性封闭位点并阻断DNA聚合酶的聚合酶活性。如上述的Taq antibody产品是通过严谨的蛋白晶体结构域预测与模拟找出聚合酶活性高效结合的潜在封闭位点，并通过高通量抗体筛选和改造技术获取得到，其酶活封闭效率可达100%。

误区2：小鼠腹水生产的抗体性能稳定性不如大规模细胞悬浮生产

与人工操作的体外模拟生长环境的罐间悬浮生产不同，一方面腹水提供了天然的细胞生长环境，营养充足，有利于杂交瘤细胞的生长，通过控制相同遗传背景的小鼠数量即可保证生产的效率。在实际的热启动封闭抗体生产中，小鼠腹水生产非常稳定高产，月产40g不是难事。另一方面腹水属于天然免疫系统，抗体折叠修饰翻译更加天然，保证了抗体的结构性能。两种方式关键点均在于设置严苛的生产流程和质控标准，对后者而言，包括生产环节中诸多要求如在超净工作台区域进行防污染的佐剂致敏，筛选出高抗体表达量的杂交瘤细胞进行细胞扩大培养等，质控环节中则要求对批次差、封闭效率、抗体纯度（核酸残留检测）、抗体用量及纯化手段的柔和度、抗体的应用效果等多质控项目指标及高标准的参数进行控制，如酶活封闭效率指标要求不低于95%。

误区3：预变性时间越短越好

PCR反应中预变性步骤是为了打开DNA中的二级结构，使DNA充分变性；如果使用了热启动DNA聚合酶，预变性步骤可以解除封闭，释放DNA聚合酶活性。

但由于DNA模板如果长时间暴露在95℃，pH<8.3的条件下容易造成脱嘌呤和断裂，DNA聚合酶长时间在高温下也可能活性降低，人们往往认为预变性时间越短越好。对此一是建议大家选择抗体封闭，因为相较于某些化学修饰法，抗体封闭的活性释放条件更温和，时间比化学修饰法短；二是提醒大家，预变性不仅是为了解除封闭释放聚合酶活性，也为了使DNA充分变性，尤其对于复杂结构模板，充分的预变性必不可少。

结语

一个好的热启动封闭抗体，要求可以有效封闭聚合酶活性的同时，不影响扩增反应。反应体系中过多的蛋白和任何核酸杂质都可能导致扩增失败，所以热启动封闭抗体要做到：1.精确封闭聚合酶活性位点；2.纯度高；3.用量少。

参考文献

[1] Kermekchiev M B, Tzekov A, Barnes W M, et al. Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a lot start for PCR [J]. Nucleic Acids Res, 2003,31(21):6139-6147

重磅消息|翊圣生物Taq酶单克隆抗体助力新冠病毒个位数拷贝检测（Cat#31301ES）

针对某IVD企业的ORF1ab、N基因的探针和引物，使用该Taq酶单克隆抗体封闭的Taq酶，翊圣生物开发了新冠检测用检测试剂盒Hifair VN nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit（Cat#13122ES），可实现个位拷贝数数目的冠状病毒的检出。

图3. 在25μl反应体系中，加入5μl 2倍浓度梯度稀释的假病毒（H4-H7）进行二重反应（FAM、VIC），每个模板测试设置20个复孔重复，检测有扩增信号的复孔个数，并用X表示。

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