来宝网 2020/4/24点击1746次
双判定标准判定qPCR扩增特异性，提升Ct值真实性
让实验小白也可以做出好的qPCR结果
qPCR实验易做，但数据分析并非想象中的那么容易！数据分析的好与坏，极大程度上依赖于qPCR原始结果的质量。
qPCR结果的评价指标
?溶解曲线，是qPCR结果判定的第一要素。它的作用是判定目的基因是否得到扩增。理论上，当反应体系中仅是目标基因的扩增，才是有效扩增。
?标准曲线，是qPCR结果判定的金标准。（在溶解曲线判定为特异性扩增后）它的作用是测定引物的扩增效率及试剂的检测上下限。根据文章发表对于qPCR数据的要求，扩增效率应在90-110%。
?扩增曲线，是直接生成qPCR定量的数据，即Ct值。从试剂对比角度而言，Ct值大小常被用于判定试剂扩增效率的高低。
产品描述
Hieff Unicon? Power qPCR SYBR Green Master Mix，这是一款旨在解决诸多qPCR实验常见疑难问题的qPCR试剂：
?它减少了大量引物验证的预实验工作，是一款具备强引物兼容性的Mix，
?它明确了qPCR溶解曲线峰型的标准——“单峰的形状”，对于“什么溶解曲线是好的溶解曲线”的解读具有参考意义，
?它让时间不再碎片化，1次体系配制，24 h时间自由支配
产品特点
□引物兼容性强：针对遵循qPCR引物设计原则设计的引物，使用Hieff Unicon? Power 引物使用率可达97%；
□模板加入量灵活：可检测10-107个拷贝个数的基因片段；
□特异性高：标准溶解曲线峰型，有效避免“胖”峰、“多”峰的出现；
□稳定性强：产品经50次反复冻融验证，扩增性能无变化；
□操作灵活：配制好的qPCR反应液4℃保存24 h，扩增性能无变化；
□扩增时间短：每个扩增循环中，退火、延伸一步完成，用时15 sec。
产品性能展示
1. 超高特异性，简化了qPCR实验的引物设计
图1. Hieff? Unicon Power预混液实现了引物的高特异性扩增 以293T细胞cDNA为模板，利用Prime5软件设计200bp扩增长度的片段（GC含量：30%-70%）的引物共1000对，随机挑选88对，使用Hieff Unicon? Power预混液测定引物的扩增特异性。通过溶解曲线分析，88个检测片段中有86个（97.7%）目标片段有效扩增，说明Hieff Unicon? Power预混液引物兼容性强，具备高特异性扩增、高检出率的特点。
2. 超高特异性，保证了Ct值的真实性
图2. Hieff? Unicon Power预混液扩增高度特异，Ct值结果可信度高 以1 ng人gDNA为模板，使用不同品牌预混液按照标准扩增程序，扩增5个目的基因片段，经琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物情况。结果显示Hieff Unicon? Power预混液针对不同靶标基因均可以高特异性扩增，得到最可信的靶标片段Ct值。
3. 检测范围宽广，模板添加不再纠结
图3. Hieff? Unicon Power预混液可有效检测6个数量级范围的模板量 以质粒DNA为模板，10倍梯度稀释（107-101 拷贝/μl），扩增IL23R基因。结果显示Hieff Unicon? Power预混液扩增特异，线性相关性高，可在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。
4. 良好的稳定性，让体系配制更加灵活：
冻融次数 | 0次 | 10次 | 30次 | 50次 |
Ct均值 | 22.97 | 22.87 | 22.99 | 22.84 |
△Ct | - | -0.09 | 0.02 | -0.12 |
4℃保存时间 | 0 h | 24 h | 48 h | 72 h |
Ct均值 | 22.83 | 22.89 | 23.05 | 23.16 |
△Ct | - | 0.06 | 0.22 | 0.33 |
图4. Hieff? Unicon Power预混液及其配制体系稳定性俱佳 以1 ng 人gDNA为模板，使用Hieff Unicon? Power预混液在不同冻融次数或体系配制后4℃放置不同时间条件下，检测TFRC基因扩增情况。结果显示Hieff Unicon? Power预混液经50次反复冻融或体系配制后4℃保存24h，扩增性能无变化（溶解曲线图数据未做展示）。
5. 兼容快速程序与标准程序：
30%GC-1号 | 30%GC-2号 | 50%GC-1号 | 50%GC-2号 | 70%GC-1号 | 70%GC-2号 | |
标准程序 | 23.4 | 22.79 | 23.79 | 23.52 | 23.23 | 23.60 |
快速程序 | 23.29 | 23.04 | 23.8 | 23.57 | 23.48 | 23.52 |
△Ct | 0.11 | 0.25 | 0.01 | 0.05 | 0.15 | 0.08 |
标准程序 快速程序
95℃ 5 min 95℃ 30 sec
95℃ 10 sec 95℃ 10 sec
60℃ 30 sec 40 Cycles 60℃ 15 sec 40 Cycles
图6. Hieff? Unicon Power预混液让扩增时间大大缩短 以1 ng人gDNA为模板，扩增不同GC基因片段（30-70%），比较Hieff Unicon? Power预混液在标准程序和快速程序下的扩增效果。结果显示Hieff Unicon? Power预混液可兼容快速扩增程序和标准扩增程序，使用快速程序可缩短扩增时间。
常见问题
Q：如何选择产品？
A：
产品名称 | 货号 | 特异性 | 扩增效率 | 灵敏度 | 性价比 |
Hieff UNICON? Power qPCR SYBR Green Master Mix | 11195ES | ★★★★★ | ★★★★☆ | ★★★☆☆ | ★★★☆☆ |
Hieff UNICON? qPCR SYBR Green Master Mix | 11198ES | ★★★★☆ | ★★★★☆ | ★★★★☆ | ★★★★☆ |
Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix | 11201ES | ★★★★☆ | ★★★★★ | ★★★☆☆ | ★★★★★ |
Q：Hieff UNICON? Power qPCR SYBR Green Master Mix产品可应用于哪些实验？
A：可用于对特异性要求比较高或较难实现特异性扩增的基因片段。这款产品极大程度上避免了引物二聚体、非特异性扩增的出现，特别适合于引物中有单个碱基不同的扩增。
Q：建议的模板加入量？
A：20 μL反应体系，未经稀释的cDNA加入量建议不超过2 μL。
Q：试剂如何储存及保质期？
A：建议-20℃保存，有效期1年。
订购信息
产品名称 | 货号 | 规格 | 价格（元） | 促销价（元） |
Hieff UNICON? Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法，No Rox) | 11195ES08 | 5 ml | ||
Hieff UNICON? Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法，Low Rox) | 11196ES08 | 5 ml | ||
Hieff UNICON? Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法，High Rox) | 11197ES08 | 5 ml |
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