来宝网 2020/4/12点击2408次
实验分享▏用数据说话，教你做双荧光素酶报告基因实验
你是否正在验证miRNA与lncRNA的作用机制？
是否在分析确认miRNA的靶基因？
在研究转录因子和启动子的实验中，你是否想确定结合位点的序列？
这些问题都可以用双荧光素酶报告基因检测系统来尝试解决。
双荧光素酶报告基因检测系统介绍
基于荧光素酶（luciferase）的发光原理，科学家发明了双荧光素酶报告基因检测系统。该系统包括萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase）。两者可催化各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，产生的荧光数值大小即表示了两种酶的表达量多少。
图1. Luciferase发光原理
Firefly luciferase和Renilla luciferase之所以被称为报告基因，是因为在基因表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可以监控、证实微观层面上的分子间的相互作用。具体做法是：将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR区或lncRNA结合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究启动子的强弱和转录因子对启动子的作用或miRNA对目的基因或lncRNA的调控作用（见图2）。与此同时，引入包含Renilla luciferase基因的TK载体作为内参，以便消除细胞转染等因素带来的组间误差。
图2.报告基因系统用于基因表达调控研究
双荧光素酶报告基因检测系统中的luciferase来源于细菌、萤火虫、发光海洋生物等，可以在哺乳细胞中直接表达，无需表达后修饰，直接具备完全酶活性。与绿色荧光蛋白（GFP）不同，它们的发光检测不需要激发光激发，且发光穿透力更强，这使其具备可定量、高灵敏度及低背景等特点。
双荧光素酶报告基因检测的应用
下面从实验方案设计、实验数据处理及结果分析几个方面介绍几个案例，供大家参考。
1、利用双报告基因检测系统研究miRNA与3’UTR的相互作用
实验目的：验证大鼠miR-1与靶基因ATG13 3’UTR是否发生作用，并进一步确定miR-1与ATG13 3’UTR的作用位点。
实验方案：构建luc-3’-UTR-WT载体和luc-3’-UTR-mut载体，将其与海肾载体及miRNA mimics共转染293T细胞，转染24-48h后使用双荧光素酶报告基因检测系统（翊圣产品货号：11402ES）检测。
实验分组：
a | Luc-NC + mimics-NC |
b | Luc-NC + mimics-miR-1 |
c | Luc-3’UTR-WT + mimics-NC |
d | Luc-3’UTR-WT + mimics-miR-1 |
e | Luc-3’UTR-mut + mimics-NC |
f | Luc-3’UTR-mut + mimics-miR-1 |
实验结果：
实验分组 | Luc值（均值） | Ren值（均值） | Ratio (均值) |
Luc-NC + mimics-NC | 185214 | 32007 | 5.798 |
| 174577 | 30016 | 5.854 |
Luc-3’UTR-WT + mimics-NC | 186580 | 32249 | 5.820 |
Luc-3’UTR-WT + mimics-miR-1 | 35773 | 30233 | 1.202 |
Luc-3’UTR-mut + mimics-NC | 186556 | 32489 | 5.757 |
Luc-3’UTR-mut + mimics-miR-1 | 188393 | 32550 | 5.821 |
图3. miR-1与3’UTR相互作用的分析（***表示p<0.001）
实验结论：
ATG13 3’UTR为miR-1靶序列。
2、利用双报告基因检测系统研究转录因子与启动子的相互作用
实验目的：验证转录因子IRF3对IFN-β启动子的调控作用。
实验方案：构建Luc-IFN-β启动子载体和IRF3的过表达载体。共转染后，使用双荧光素酶报告基因检测系统（翊圣产品货号：11402ES）检测分析荧光值差异。
实验分组：对照组为Luc-IFN-β和pTK-RL，实验组为Luc-IFN-β、pTK-RL和IRF3的过表达载体共转染。
实验结果：
实验分组 | Luc值（均值） | Ren值（均值） | Ratio (均值) |
对照组 |
| 456979 | 0.15 |
实验组 | 462790 | 16248 | 28.48 |
图4. IRF3对IFN-β启动子的调控
实验结论：转录因子IRF3对IFN-β启动子起正调控作用。
影响双荧光素酶报告基因检测的因素
作为报告基因检测试剂研发的厂家，我们为大家总结了获取好数据的方法，避免大家掉坑：
坑1：检测数值太低
正常表达水平下，荧光值的数量级应在104-107数量级左右，导致数值低主要有以下几个原因：启动子活性、转染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不规范等原因，具体的原因需要实验者进行排查。相应的解决方案如下表：
实验问题 | 解决方案 |
转染效率低 | 1、确保细胞状态是良好的，通常选择指数分裂期的细胞进行转染； 2、可以选择过表达的荧光蛋白质粒作为阳性对照； 3、转染试剂的选择也至关重要，比如在做miRNA研究的实验中，如果Lipo2000或Lipo3000的转染效率不能满足的话，可以选择更换其它转染试剂。 |
裂解不充分
| 1、细胞培养时间不宜过长，最好不超过36h，培养时间过长的话，细胞难裂解 2、裂解液的量要足以充分裂解细胞 3、实验对象为烟草叶片时，可在EP管中加入液氮和预冷的小钢珠对叶片进行研磨，使裂解更充分 |
底物失效
| 1、底物保存的时候要避光低温保存，尤其是腔肠素，推荐-80℃保存。 2、反应工作液建议现配现用。 |
操作不当 | 荧光素酶的半衰期一般约30min，加完底物后可立即检测，尽量在30min内完成。 |
坑2. 复孔差异大
双报告基因检测系统较为灵敏，检测结果受多种因素的影响，因此，一般设置3个或3个以上的复孔，复孔之间有差异是正常的，差异在同一个数量级可以接受。想要得到更准确的实验结果，需尽量减少复孔的差异性，建议如下：1、裂解后建议离心取上清，保证样本均一性；2、保证加样的准确性；3、样品和底物混合后到检测前的时间以及检测时间应控制在相同的时间内。
以上的实验方案和建议是否对您有帮助呢？如有不解欢迎致电小翊。祝大家实验顺利~
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