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外泌体（exosome）研究整体思路

背景

外泌体（Exosome）是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中；外泌体携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。

图1：外泌体的分泌以及外泌体的组成

外泌体研究路线

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实验结果：

外泌体应用

1、外泌体在肝癌发展、诊断和治疗中的作用

首都医科大学附属北京佑安医院李伟华等人在Molecular Cancer杂志发表的有关外泌体研究的综述：分别介绍了1、外泌体在慢性乙型肝炎至肝细胞癌过程中的作用 2、外泌体与肝细胞癌的关系 3、外泌体在肝癌诊断和预后中的应用 4、外泌体在肝癌治疗中的应用，对相关涉及的最新研究内容进行总结以揭示外泌体在肝癌的发生，发展，诊断和治疗中的重要性，为研究人员进一步阐明外泌体在肝癌中的作用机制，并促进外泌体在临床诊断中的应用和肝癌的治疗提供参考。

引自：Li X, Li C, Zhang L, Wu M, Cao K, Jiang F, Chen D, Li N, Li W. The significance of exosomes in the development and treatment of hepatocellular carcinoma. MolCancer. 2020 Jan 4;19(1):1.

2、外泌体介导的miR-567在乳腺癌曲妥珠单抗中的关键作用

2020年1月22日，郑州大学第一附属医院韩明利等人在Cell death&disease杂志发表的文章提供来自乳腺癌和生物信息学分析的可公开获得的表达谱数据被用于筛选曲妥珠单抗耐药的潜在miRNA进行增益或缺失功能测定。结果表明，与应答患者相比，曲妥珠单抗耐药患者的miR-567显着降低；与亲代细胞相比，曲妥珠单抗耐药细胞中的miR-567也下调。miR-567的过表达逆转了化学耐药性，而miR-567的沉默在体外和体内均可诱导曲妥珠单抗。揭示了miR-567在抑制自噬和增加对曲妥珠单抗的化学敏感性中的基本作用，表明它可能是乳腺癌患者的有希望的治疗靶点和预后指标。

引自：Han M, Hu J, Lu P, et al. Exosome-transmitted miR-567 reverses trastuzumab resistance by inhibiting ATG5 in breast cancer. Cell Death Dis. 2020;11(1):43. Published 2020 Jan 22.

外泌体标记检测

一、亲脂性染料 :PKH-67（green）/PKH-26（red）

染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞失踪研究。

图6：PKH67标记外泌体被巨噬细胞吸收

引自：Wang Z, Maruyama K, Sakisaka Y, et al. Cyclic Stretch Force Induces Periodontal Ligament Cells to Secrete Exosomes That Suppress IL-1β Production Through the Inhibition of the NF-κB Signaling Pathway in Macrophages. Front Immunol. 2019;10:1310. Published 2019 Jun 20.

二、亲脂性羰花青染料（carbocyanine dyes）:DiI/DiD/DiO/DiR

DiI, DiO, DiD, DiR是一系列亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。

引自：Tian T, Zhu YL, Zhou YY, Exosome uptake through clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis and mediating miR-21 delivery. J Biol Chem. 2014 Aug 8;289(32):22258-67

引自：Wiklander OP, Nordin JZ, O'Loughlin A, et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.J Extracell Vesicles. 2015 Apr 20;4:26316.

三、渗透型的化合物标记法：CFSE/CFDA/Calcein-AM

1、CFSE：羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯，常称为 CFSE，可被动扩散进入细胞。 这种试剂没有颜色和荧光，直至细胞内的酯酶去除其醋酸盐基团，产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯。 琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应，形成稳定且能用醛固定剂固定的荧光偶联物。

引自：Escrevente, Cristina et al. “Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.” BMC cancer vol. 11 108. 27 Mar. 2011,

2、Calcein-AM：Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出荧光被检测到。

引自：de Rond L, Libregts SFWM, Rikkert LG, et al. Refractive index to evaluate staining specificity of extracellular vesicles by flow cytometry. J Extracell Vesicles. 2019;8(1):1643671. Published 2019 Jul 25.

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