来宝网 2019/7/19点击2085次
Qubit核酸浓度检测，小翊送你最全资料汇总（包含实验常见问题解析）
背景简介：
目前，实验室大多采用分光光度计来对DNA和RNA进行定量。虽然这种方法被广泛采用，但并不意味着它的读数是准确而可靠的。因为紫外吸光度测量不具有选择性，无法区分DNA、RNA或蛋白质，同时一些游离核苷酸或多余的盐离子也会影响检测的数值。此外，紫外分光光度计的灵敏度不足，无法完成低浓度DNA和RNA的精确定量。
基于此，Life Technologies（赛默飞世尔旗下）推出了Qubit，我们一起来探索一下qubit的神奇之处。
Qubit荧光计
Qubit荧光计是新一代核酸和蛋白定量仪，是Thermo研发生产的一种检测核酸质量和数量，并对RNA、ssDNA、dsDNA、蛋白质等进行定量的小型仪器，主要用于需要进行高灵敏性、高特异性及高精确度测量的实验应用。 目前主要是以qubit3.0和qubit4.0为主。
图1. Qubit3.0（左）与Qubit4.0（右）仪器图
仪器原理
采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，配套只有与DNA、RNA或蛋白质结合后才发出荧光的特异性荧光染料。这些荧光染料只有与特异性的靶分子结合时才能发出荧光信号，采用专门的荧光检测技术，检测特定目标分子的浓度，从而对DNA和RNA进行精准定量。
实验操作
简单两步
1. 配置标准品并测量，仪器自动校正并生成标准曲线；
2. 配置检测样本，上机检测
图2. Qubit实验操作流程图
特点
Qubit技术只检测靶分子（而不是污染物）的浓度，比如：Qubit检测双链DNA浓度时，特异性检测待测样本中的的双链DNA，对于样本中存在的单链DNA或者RNA不检测。
这种特异性可以获得十分精确的结果，对于芯片分析（Microarray）和实时定量PCR（qPCR）而言，精确测定样本中的DNA或RNA是必需的。同时在新一代测序（NGS）实验中，对我们后续的精确建库过程也是很必要的。
常见问题汇总
1.Qubit检测能否指示核酸样品中的样品质量？
不能，Qubit 检测仅 样品中DNA/RNA的量。 Qubit荧光计不能获取吸光度读数以提供A260 / A280比率或检测核酸样品中的蛋白质。质量情况可以使用NanoDrop仪器完成。
2. 产品成分只有两个标准品，制作标准曲线的时候需要对standard 2进行稀释吗？
使用产品时可直接用两个标准品测定荧光值后做标准曲线，即两点连成直线。
如果想稀释多个梯度制作标准曲线，也可以使用1×TE对standard 2 进行梯度稀释。
另如果担心96孔板测试时候荧光相互干扰，可选择黑色的底部透明板。
3.使用酶标仪做Qubit检测，Ex值480 nm，Em值520 nm，但是我用的仪器没有这两个波长设置，其他的波长测定可以吗？准确度和灵敏度与酶标仪相比如何？
可以，picogreen的吸收峰如下图，可知Ex在480nm处有最大吸收峰，Em在520nm处有最大吸收峰，而如果仪器波长不在这两个上面，也是可以测定的，只不过荧光值会低一点的。
Qubit定量分析的准确度和灵敏度与酶标仪的准确度和灵敏度相同。 这是产品开发过程中的一项要求。
4. 为什么要做复孔？
Qubit是一个灵敏度比较高的浓度测定仪器，测量值与样本的质量和外界的温度都有关系，增加复孔可以有效降低测量过程中带来的误差，保证数据的可准确性。
5. 复孔对应的数据不一致？
1）操作误差；2）样本质量差，浓度低对应的误差较大；3）片段长度不均一（Qubit里面的染料对于不同长度的DNA结合能力有差别，重复对应的时间不同，荧光值不同）
6. 环境温度不同，测试的值会不同吗？
会的，Qubit里面对应的荧光染料在不同的温度下对应的荧光信号强弱会有偏差的，一般在低温测出的值会偏大大，高温测出的值偏小（在试剂盒中标准品恢复室温测试时，整体误差范围在10%左右，极限误差在15%左右）
7. 测试复孔的时候，连续测，不取出来，为什么值越来越小？
连续在激发光激发的情况下，荧光染料的半衰期会降低，此时对应收集的荧光信号会降低，对应的数据会偏低，建议读取完数据之后，从仪器中取出，5min左右再去测量，基本不会有什么偏差
8. 如何检测Qubit试剂的测试准确性？
1）相对准确，参考life对应试剂测量，对比结果分析；
2）绝对准确，试剂盒中配套的标准品，经过适当稀释之后，上机测试，对比结果分析
对应产品
dsDNA HS Assay Kit for Qubit®
——5min准确定量结果
dsDNA Assay Kit for Qubit®是Yeasen生物开发的专门用于Qubit®荧光仪或荧光酶标仪的试剂盒，线性范围0.2-100 ng，即使在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下，也可以选择性的检测dsDNA，且耐受较高浓度的蛋白质、盐类、洗涤剂等污染物。
