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分子酶专栏之耐热型DNA聚合酶（中篇）

一．来自Thermus耐热菌的A型DNA聚合酶

Thermus属的细菌属于Deinococci纲，它们的最佳培养温度是65~70℃，可在80℃的极端温度条件下生存。这些细菌中的耐热A型DNA聚合酶与真核生物中的聚合酶I是同源的，早在1976年就被发现，而且已经有越来越多的Thermus DNA聚合酶被发现和表征。这一类酶有几点共性，包括94~95 kDa左右的蛋白分子量、内生的5’-3’方向核酸外切酶活性、缺乏3’-5’方向核酸外切酶活性。可见，这些酶在扩增过程中，都不具有保真性，他们的保真性只能通过调节镁离子和dNTP的量来实现，通常认为当dNTP和镁离子的摩尔浓度一致的时候，扩增保真性最高。此外，这些会在扩增产物的3’端加一个dA尾，可以与特殊的载体进行快速连接并转化，即我们常说的TA克隆。

Taq

说起Taq酶，它可谓是A型DNA聚合酶中的明星成员，也是我们最熟知的PCR扩增酶。它的天然蛋白来自Thermus aquaticus，该菌是从黄石公园里热泉中发现的。第一次分离并报告该酶的科研工作者是我国台湾的女科学家钱嘉韵女士，只是当时还没有PCR技术，该工作未被重视。Taq酶的最适扩增温度是在75~80摄氏度之间，但当模板的GC含量比较低的时候，可以适当降低延伸温度。相比其他的PCR扩增酶，Taq酶的耐高温能力只能用一般来形容，其半衰期是95℃下40分钟或97.5℃下9 min。如果不想让Taq酶在PCR的升温过程中发挥不必要的扩增活性，可选择制备其热启动版本（hot-start）。常用的方案有三种：1）化修饰、混合封闭扩增活性的抗体、核酸适配体封闭。每一种方法在经济型和封闭效果上都有相应的优缺点，具体选择哪一种，还需要自行考虑。

野生型Taq酶扩增效率不高，大概在80%左右，而且随着扩增产物长度增大，效率随之减小。为克服这个缺点，人们选择将Taq酶与一种耐热的DNA结合蛋白进行融合表达，以提高整体的蛋白-核酸复合物的稳定性。常用的结合蛋白是来自Sulfolobus solfataricus 的Sso7d DNA 结合蛋白或来自Sulfolobus acidocaldarius的Sac7d。

另外一个值得注意的点是Taq酶的保真性，当然我们都知道Taq酶没有3’-5’端的外切酶活性，因此它的保真性相比Pfu或Vent低。目前新报告的保真性是1.2×10-5 至3.3 ×10-6次方，单论这个值的话，已经超过了最初报道的保真性数据，也就是说Taq酶并没有我们想的那么不保真。

Tfi and Tfl

Tfi和Tfl是分别来自Thermus filiformis菌和Thermus flavus菌的DNA聚合酶，也已经被用于PCR扩增。这两个酶的各项指标与Taq酶类似，只是扩增速度和延伸长度要比Taq强。此外，Tfi没有专利限制，如果作为商用的话，可不必支付高昂的专利费。

Tth

Tth DNA聚合酶来自Thermus thermophilis菌，这个酶比较特殊，它同时具有DNA聚合酶和反转录酶的性能。首先在DNA聚合酶方面，它比Taq酶要更耐高温，其最适延伸温度范围为70~75℃，而且比Taq酶更耐受一些PCR反应抑制物。其次，当Tth酶在锰离子环境中表现出一种高活性的反转录特性（在镁离子中表现DNA聚合酶活性），结合它的耐热活性，可以很好的克服反转录过程中RNA二级结构带来的反转录难点问题。而且，Tth酶的反转录性能并没有伴随RNase H活性的产生，这点要比目前常用的M-MLV反转录酶更有优势。综合考虑以上几点特性，Tth酶非常适合应用于一步法反转录-扩增的实验，包括一步法反转录荧光定量的实验。

二．来自Thermococcales目的B型DNA聚合酶

Pyrococcus和Thermococcus属于古生菌广古菌目和热球菌目。这些极端嗜热菌和它们内生酶历来受到生物技术应用的广泛关注。许多这些细菌中的B型DNA聚合酶已经被分离、重组表达及专利授权，并已经投入商业应用。

Pyrococcus极端嗜热，它最初是在深海的火山蒸汽口的100℃环境中分离的。所有来自Pyrococcus的B型DNA聚合酶的分子大约都在90 kDa，并具有3’-5’外切酶活性，可去除DNA合成过程中的碱基错配，但没有末端转移酶活性。相比Taq酶，这些B型DNA聚合酶具有更高的耐热性能，延伸长度和保真性，大部分酶可在商业公司买到。

Thermococcus也是一种极端嗜热的海洋古生菌，它们的DNA聚合酶具有与Pyrococcus菌聚合酶类似的特性，但在保真性方面有略优于后者，它们的分子量在80~90 kDa左右。Thermococcus属中有一个明星物种：Thermococcus kodakarensis，来自它的一种B型DNA聚合酶就是大名鼎鼎的KOD DNA聚合酶。最初人们把它误认为属于 Pyrococcus 并命名为 Pyrococcus sp. KOD1，后来根据16s RNA序列比对，才把其划归Thermococcus属。

Pfu

Pfu酶的名气很大，它是最早被发现及广泛应用于高保真DNA扩增应用的耐热聚合酶，它来自极端嗜热菌属的Pyrococcus furiosus。Pfu酶具有一切高保真DNA聚合酶应有的特性，而且它的最大亮点是超低的DNA合成错配率，大约1.0×10-6(mf×bp^-1×d^-1)。PCR过程中的最适pH范围在8.5和9.1，增加镁离子浓度至10 mM并不会影响其扩增保真性。在已知的扩增突变测试中发现，GC→TA、AT→TA、AT→CG的突变率较高。Pfu具有强烈的3’-5’方向的核酸外切酶活性，这是其具有高保真能力的原因，但同时这个活性易降解引物，不利于扩增。有人设计pfu突变体，去除它的外切酶活性进行。虽然增加了扩增能力，但是降低了约40倍的保真性。Pfu酶在扩增高GC模板时表现比较出色，将buffer中的氯化钾替换成氯化钠，并添加20%的DMSO可成功扩增70%GC含量的模板。Pfu酶的持续扩增能力比Taq酶要强，但是扩增速率比较慢，这可以通过融合Sso7d或Sac7d来改善。最后一点，Pfu这类B型DNA聚合酶具有read-ahead特性，表现为在PCR扩增中不能扩增使用dUTP或识别含dUTP的模板。对于前者来说，dUTP的产生是由于PCR过程中dCTP脱氨基造成的，可在PCR体系中额外添加dUTPase来消化dUTP。对于后者的解决，目前比较高效的是将Pfu进行定点突变，使其耐受dUTP模板。

KOD

KOD酶是继Pfu后比较受关注的高保真DNA聚合酶，它来自于一种嗜热菌，最初是从日本鹿儿岛含硫气孔中分离得到的，命名为Thermococcus kodakarensis。KOD具有极佳的耐热效果，其在95℃条件下的半衰期是12h。KOD的扩增速度比同类型的B型DNA聚合酶快很多，达到6~7 kb/min。其保真性为2.6×10^-6(mf×bp^-1×d^-1)，比pfu略低，，但比Taq酶要高很多。KOD可扩长片段，但是产量很低。有一个折中的方案是混合KOD及KOD exo-（KOD的外切酶突变体），在折中策略下可以扩增15 kb的片段。KOD的热启动版本具有强烈的GC耐受性，被两种单克隆抗体封闭活性的KOD，据称可以扩增高达90%GC含量的模板。

虽然KOD比Taq和pfu发现的晚，但是它的商业应用却一点也不比前两者含糊。目前你可以在不同的应用场景看到它的身影，包括基因敲除、基因克隆、长基因扩增、cDNA第二链合成、文库构建等领域。