双荧光素酶报告基因检测系统

——更亮、更快、更准

关键词  双报告基因检测  萤火虫荧光素酶  海参荧光素酶  荧光素（luciferin）  腔肠素（coelenterazine）

产品背景

双荧光素酶报告基因常用于启动子对基因表达影响的研究。将所研究目的基因的调控序列克隆到含有报告基因的表达质粒中，然后将重组质粒导入适当的细胞系，通过测定报告基因表达的水平来间接评价在调控序列指导下启动子对基因表达的诱导作用。

荧光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性荧光素酶，转录后无需修饰即具有报告基因的功能。

产品原理

萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）大小为61KDa，单亚基蛋白，能够催化荧光素（luciferin）氧化，生成氧化荧光素oxyluciferin；海参荧光素酶（Renilla luciferase）为36 KDa的单亚基蛋白，能够催化腔肠素（coelenterazine）氧化形成coelenteramide。二者在翻译后均无需修饰即可发挥作用。

通常情况下，海参荧光素酶作为内参，用以减少内在因素的某些变化对实验所造成的影响。

该试剂盒先对转染后的细胞进行裂解，然后以荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶的活性，之后在淬灭该荧光反应的同时，以腔肠素为底物检测海参荧光素酶报告基因的活性；具有检测信号强、线性范围广、无内源活性干扰等特点。

产品特点

  裂解能力更强：能够彻底裂解绝大部分种类细胞。

  信号更强：能够精准检测弱启动子的表达。

  灵敏度更高：可检测低至10^‐20摩尔荧光素酶分子。

  线性范围更广：线性检测范围超过酶浓度的8个数量级。

操作流程

加入海肾荧光素酶反应液的作用1：淬灭萤火虫荧光素酶的发光  2：加入海肾荧光素酶的底物腔肠素

产品数据

检测试剂和荧光素酶相互作用，可获得最佳的发光强度

加入海肾荧光素酶底物后，萤火虫荧光素发光淬灭情况：基本能够完全淬灭。

产品价格

FAQ

Q1：双荧光素酶报告基因最适反应温度？

A：室温（20-22℃）。反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温。此两种荧光素酶的反应速率是受温度影响的，为了保证实验的一致性，我们推荐此两种工作液在检测时都孵育至室温。

Q2：双荧光素酶报告基因载体该如何选择？

A：1）萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4或者自己构建的载体

   2）海参荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4载体或者自己构建相应的载体。建议海参载体不使用强启动子（如SV40、CMV），而选用中等强度的启动子（如TK）。

Q3：检测的荧光数值很低怎么办？

A：检测的荧光数值很低说明细胞裂解液中的荧光素酶含量很低。通常解决办法为

1）转染的质粒采用细胞转染级别的质粒抽提试剂盒抽提。

2）优化转染条件，尽可能的提高转染效率。

3）增加实验的细胞量，并且裂解细胞时，适当减少细胞裂解液的量。

Q4：进行检测的过程中，荧光信号值太高该如何进行调整？

A：1）在转染实验后，减少细胞的孵育时间。

2）降低荧光信号采集时间。

3）进行样品的稀释。

Q5：萤火虫荧光素酶读值和海肾荧光素酶读值的比例多少时比较合适？

A：尽量保证对照组的萤火虫荧光素酶的读值和海肾荧光素酶的读值接近，或者海肾荧光素酶的读值比萤火虫荧光素酶的读值稍高。对于具体的实验过程中，由于萤火虫荧光素酶质粒和海肾荧光素酶的质粒抽提的质量不一致，待检测目的调控元件的调控能力的不同等原因，一次实验很难达到一个比较好的实验结果，因此对于此实验，我们推荐预实验优化萤火虫荧光素酶质粒和海肾荧光素酶质粒的共转染量。

Q6：细胞培养、转染时使用96孔板还是6孔板或者其他规格的细胞培养板？

A：本试剂盒最低检测限约为10^-10 mg/mL 荧光素酶。一般来说，如果能保证10%的转染效率，96孔板的细胞量就能够达到实验要求。如果细胞很难转染或者待检测的调控原件的调控作用很弱，可以增加实验的细胞量。

Q7：此试剂盒采用何种仪器检测比较好？

A：能够检测化学发光或者生物发光的仪器都可适用于此试剂盒。如果使用多功能酶标仪，为防止各孔之间的干扰，我们推荐使用黑色酶标板，并且不同实验组之间最好有间隔。

Q8：萤火虫荧光素酶反应工作液和海肾荧光素酶反应工作液如何配置，配置之后如何保存？

A：本试剂盒中萤火虫荧光素酶底物和海肾荧光素酶底物统一采用50X的包装形式。分别用相应的缓冲液配置成1X 工作液即可。例如取100 μL（50X） 萤火虫荧光素酶底物加入到5 mL萤火虫荧光素酶缓冲液中，即为萤火虫荧光素酶反应工作液。

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