来宝网 2017/5/31点击2608次
一气呵成，Hieff Clone攻无不“克”
Yeasen Hieff CloneTM 一步法克隆试剂盒荣登SCI顶尖期刊:《Cell》《Science》.
详情点击： http://www.yeasen.com/CompanyNews/1930.htm
http://www.yeasen.com/CompanyNews/1951.htm
基于限制性内切酶和T4 DNA连接酶的经典分子克隆技术，易出现假阳性，克隆效率不高。此外，该技术受到多种实验因素的限制，包括酶切位点的选择、插入片段制备繁琐、T4 DNA连接酶序列的偏好性、连接反应时间长等。
提高克隆效率的关键，增加配对碱基数
图1. 几种克隆方法连接效率的比较
翊圣生物经数年潜心研究，精益求精。摸索与优化反复循环，实现了“末端同源重组技术”由理论到应用的升级，研发出Hieff CloneTM系列克隆产品。该系列产品克隆效率显著提升，可达95%以上。基于同源重组的方式，该系列产品无需考虑酶切位点，适用于任何载体和任意片段的连接。同时兼具连接反应时间短（20 min）、操作简单等优势。
非凡匠心，带来极致品质
翊圣生物在成熟的工具酶表达纯化平台基础上，获得高纯度重组酶，并反复优化重组酶反应微环境，保证Hieff CloneTM克隆试剂盒的最佳品质。它可以将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。Hieff CloneTM克隆试剂盒简便、快速、高效，是无缝克隆的首选。
产品优势 |
● 无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点的限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。
● 设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。
● 快速高效：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
● 应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变。
方法对比
方法 | 目的片段制备步骤 | 酶切位点 | 通用性 | 连接时间 | 阳性率 |
一步法同源重组 | 仅需1步 | 不受目的片段限制 | 高 | 20 min | 95%以上 |
传统酶切酶连 | 需要2步 | 受到目的片段限制 | 低 | 过夜 | 不同基因差别大 |
实验流程 |
Hieff CloneTM一步法快速定向克隆试剂盒分为单片段克隆和多片段克隆试剂盒，实验流程见下图。
图2：Hieff CloneTM一步法快速定向克隆试剂盒进行单片段和多片段克隆实验流程图。
①线性化载体的制备：酶切或PCR制备线性化载体。②插入片段的制备：在目的DNA片段上下游引物的5’端引入20 bp左右载体末端同源序列；PCR反应扩增目的片段。③重组反应：按比例混合线性化载体和目的DNA片段进行重组，50℃反应20 min。④转化、涂板：将重组产物直接转化后涂平板。挑取克隆。
产品数据 |
★ 单片段高效重组
图3：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit可以有效克隆不同长度的单片段基因。
A-D：重组转化平板。E：插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H：插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分别是1.2 kb，3 kb和5 kb，载体与插入片段摩尔比：1:3，重组反应条件：50℃，20 min。
★ 多片段轻松重组
图4：Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit进行三片段克隆。
A：重组转化平板。B：插入片段和载体浓度检测电泳图。C：PCR方法鉴定每个单片段和最终连接基因。箭头指示目的条带。载体：pCAMIBA1302，10 kb，三个插入片段长度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重组反应条件：50℃，20 min。
★ 载体与插入片段摩尔比1:3左右最适
图5：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit进行单片段和载体不同摩尔浓度比例重组克隆测试。
A-C：重组转化平板。载体与插入片段的分子摩尔数比分别是1:2（A），1:3（B）和1:4（C），重组反应条件：50℃，20 min。
★ 重组反应时间20-30 min最佳
图6：Hieff CloneTM One Step Cloning Kit进行不同重组反应时间克隆测试。
A-C：重组转化平板。重组反应时间分别是20 min（A），25 min（B）和30 min（C），重组反应温度：50℃。
客户反馈 |
◆ 超高的阳性率
图7：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit进行克隆，阳性率100%。
A：重组转化平板。B：克隆基因PCR鉴定电泳图。载体：10 kb，插入片段：300 bp，载体浓度：50 ng/μL，插入片段浓度：50 ng/μL，载体与插入片段摩尔比例为1:1，重组反应条件：50℃，20 min。(中国科学院植物生理生态研究所)
◆ 低浓度载体重组
图8：使用Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit进行克隆。
A：重组转化平板。B：载体浓度检测电泳图。C：插入片段浓度检测电泳图。D：克隆基因PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体4.7 kb，插入片段1.6 kb，载体浓度：5 ng/μL，插入片段浓度：25 ng/μL，载体与插入片段摩尔比例为1:2，重组反应条件:50℃，20 min。(西南大学)
高性价比 |
图9：Hieff CloneTM Plus Multi One Step Cloning Kit与不同品牌的同类产品相比，显示出更高的性价比。
客户使用情况 |
已得到广大用户认可——使用客户数量600+
主要有：中国科学院上海生命科学研究院，北京大学，中国农业大学，清华大学生命科学学院，华东理工大学，上海交通大学，复旦大学，华中农业大学，浙江大学，中国药科大学，武汉大学，中山大学，东南大学，南京林业大学，华南农业大学，南京农业大学，南方医科大学，山西师范大学，中国农业科学院中国水稻研究所，中国科学院水生生物研究所，暨南大学，中科院健康科学研究所，中国科学院动物研究所，华东师范大学，同济大学，中国科学院微生物研究所，第二军医大学，上海市东方医院，上海植物逆境生物学研究中心，中国农业科学院上海兽医研究所，中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，浙江大学医学院附属第二医院，中国科学院植物研究所，中国科学院南京土壤研究所，中国科学院遗传与发育生物学研究所，中国科学院上海有机化学研究所，中国科学院生物物理研究所，中国科学院南海海洋研究所，中国林科院亚热带林业研究所，浙江省农业科学院等单位的课题组。
常见问答 |
Q：Hieff CloneTM克隆的原理是什么？
A：利用末端同源重组的原理。将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。
Q：与传统克隆相比，Hieff CloneTM克隆有什么优势？
A：1）无需考虑酶切位点：不受插入片段酶切位点的限制，适用于任何载体；插入片段兼容粘性或平末端。
2）设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。
3）快速高效：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。
4）应用广泛：可用于单片段或多片段定向克隆，也可结合Canace高保真酶，应用于定点突变。
Q：同源序列长度对重组效率的影响？
A：同源序列的长度与克隆数目有相关性，一般同源片段选择在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范围内调整。并且选择尽量避免出现二级结构。
Q：线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗？
A：线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，建议割胶回收纯化产物。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗？
A：推荐使用转化效率为108 cfu/μg的感受态细胞。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES），TOP10（cat NO. 11801ES）等。
Q：线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例？
A：载体使用量应大于0.01 pmol，推荐使用量0.03 pmol；克隆载体与目的片段摩尔比应在2:1-1:5范围内，最适为1:2-1:3，超过范围可能会影响克隆效率。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒适用实验有哪些？
A：本试剂盒适用于绝大多数基于常规“酶切-连接”方法的克隆实验，并且特别适用于其它常规方法难以快速实现的基因多点突变、全基因合成等。
Q：多片段一步法快速定向克隆试剂盒可以用于单片段的克隆吗？
A：多片段一步法克隆试剂盒可以用于单片段的克隆。但是，单片段克隆试剂盒不建议用于多片段的克隆，重组效率可能会受到影响。
Q：一步法快速定向克隆试剂盒反应温度是50℃，是否可以在37℃进行反应？
A：一般情况下建议在50℃进行反应。50℃有利于消除DNA的二级结构，同时是Hieff CloneTM重组酶的最适反应温度。37℃反应条件也可以进行重组反应，请根据实验需要进行优化。
产品发表文献 |
[1]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017. （中科院植物生理生态研究所，王二涛组）
[2]. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16.（中科院生物化学与细胞生物学研究所，陈玲玲组）
[3]. Zhu T, Zhao Y, Wu Y, et al. The Staphylococcus epidermidis gdpS regulates biofilm formation independently of its protein-coding function[J]. Microb Pathog, 2017,105: 264–271.（皖南医学院）
[4]. Li N, Hong T, Li R, et al. Cherry Valley Ducks Mitochondrial Antiviral-Signaling Protein-Mediated Signaling Pathway and Antiviral Activity Research[J]. Front Immunol, 2016,7:377.（山东农业大学）
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[7].Lu, J., et al., Tiron Inhibits UVB-Induced AP-1 Binding Sites Transcriptional Activation on MMP-1 and MMP-3 Promoters by MAPK Signaling Pathway in Human Dermal Fibroblasts[J]. PLoS One, 2016. 11(8): p. e0159998.（上海交通大学）
[8].Wu, R., et al., Direct regulation of the natural competence regulator gene tfoX by cyclic AMP (cAMP) and cAMP receptor protein (CRP) in Vibrios[J]. Sci Rep, 2015. 5: p. 14921.（中国疾病控制与预防中心）
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订购信息 |
产品名称 | 产品货号 | 规格 | 促销价(元) |
Hieff CloneTM One Step Cloning Kit | 10905ES25 | 25 T | 439.00 |
10905ES62 | 5×25 T | 1869.00 | |
Hieff CloneTM Multi one Step Cloning Kit | 10906ES10 | 10 T | 409.00 |
10906ES50 | 5×10 T | 1749.00 | |
Hieff CloneTM Plus One Step Cloning Kit | 10911ES25 | 25 T | 439.00 |
10911ES62 | 5×25 T | 1869.00 | |
Hieff CloneTM Plus Multi one Step Cloning Kit | 10912ES10 | 10 T | 409.00 |
10912ES50 | 5×10 T | 1749.00 |
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10136ES03 | 5×1 mL | 1426.00 | |
10136ES08 | 25×1 mL | 5626.00 | |
Top10化学感受态细胞 | 11801ES80 | 10×100 μL | 166.00 |
11801ES92 | 100×100 μL | 1236.00 | |
DH5α化学感受态细胞 | 11802ES80 | 10×100 μL | 166.00 |
11802ES92 | 100×100 μL | 1236.00 | |
XL10化学感受态细胞 | 11803ES80 | 10×100 μL | 265.00 |
BL21 (DE3)化学感受态细胞 | 11804ES80 | 10×100 μL | 280.00 |
JM109化学感受态细胞 | 11807ES80 | 10×100 μL | 189.00 |
Stbl2 化学感受态细胞 | 11811ES80 | 10×100 μL | 288.00 |
Ampicillin, Sodium Salt 氨苄青霉素钠 | 60203ES10 | 10 g | 768.00 |
60203ES60 | 100 g | 968.00 | |
Chloramphenicol, USP Grade 氯霉素，USP级 | 60205ES08 | 5 g | 48.00 |
60205ES25 | 25 g | 1428.00 | |
60205ES60 | 100 g | 208.00 | |
Kanamycin Sulfate 硫酸卡那霉素 | 60206ES10 | 10 g | 169.00 |
60206ES60 | 100 g | 1436.00 | |
Tetracyclin HCl 四环素盐酸盐，USP级 | 60212ES25 | 25 g | 168.00 |
60212ES60 | 100 g | 678.00 |
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