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如何完成一次高效又经济的Tunel检测？

——Yeasen TUNEL detection Kit 让“美”原位呈现

关键词：凋亡检测；Tunel检测；Tunel法

通过TdT转移酶将Fluorescein-dUTP结合到有缺口的DNA上是检测细胞凋亡的常用方法之一，如Roche提供的In Situ Cell Death Kit正是基于这个原理。产品中的TdT转移酶活性直接影响到标记的效率。翊圣生物立足于酶制剂生产，力求开发以酶制剂为基础的最具性价比产品，推出三款荧光素（Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 488，FITC）标记的Tunel检测试剂，在满足客户对产品高品质要求的同时又可以享受低至Roche一半的价格。

目前已经有超过120个课题组正在使用该产品，并在权威杂志上发表多篇英文文章，如Theranostics和EMBO Molecular Medicine等。

检测机理：

细胞凋亡晚期，染色体DNA双链断裂或单链断裂产生大量的粘性3-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移（TdT）的作用下，将荧光素/酶标记的dUTP结合到DNA的3-末端，从而可通过检测荧光完成对细胞凋亡的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal-Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL），原理见图1。

图1：脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）原理图

产品特点:

适用范围广：可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞。

检测灵敏度高：可检测出极少量的凋亡细胞。

背景干扰小：信噪比高。

观察多样性：荧光显微镜观察，流式检测。

数据展示：

1、小鼠前脂肪细胞（3T3-L）Tunel检测

图2：小鼠前脂肪细胞3T3-L凋亡检测。第一行代表阴性对照，第二行代表阳性对照。

检测试剂：Cat No. 40306 TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

2、石蜡切片样本的Tunel检测

图3：在皮下移植瘤模型中，单独使用LY3009120或联合使用Vemurafenib和Obatoclax可以有效延缓甲状腺癌^[5]。IF=8.8

样本类型：石蜡包埋的肿瘤组织（取自裸鼠）。检测试剂：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)。

3、细胞爬片的Tunel检测

图4：硫酸锌对不同分组的内皮细胞凋亡的影响^[11]

样本类型：HUVEC（人脐静脉内皮细胞）。检测试剂：Cat No. 40308 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 647)

4、流式细胞术检测细胞凋亡

图5：PA处理可以有效降低重编程（reprogramming）过程中凋亡的发生^[9]。IF=3.7

样本类型：iPS Cells。检测试剂：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)。

文献引用：

[1] Qiang S, Zhiyong F, Wencheng L. MicroRNA-137 inhibits optosis of neuron cells in injured spinal cord by targeting calpain 2. Int J Clin Exp Med 2016; 9(8):15796-15803.IF=1.075

[2] Xiu-yun S, Ying-ying W, Shi-feng C, et al. A new coumarin derivative, IMM-H004, attenuates okadaic acid-induced spatial memory impairment in rats. Acta Pharmacologica Sinica 2016; 37: 444–452.IF=3.166

[3]Guoxu X, Daohuan K, Chaoyang Z, et al.Erythropoietin Protects Retinal Cells in Diabetic Rats Through Upregulating ZnT8 via Activating ERK Pathway and Inhibiting HIF-1a Expression.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015; 56: 8166–8178.IF=3.427

[4]Juanjuan L, Deping K, Qi W, et al.Niacin ameliorates ulcerative colitis via prostaglandin D2-mediated D prostanoid receptor 1 activation. EMBO Molecular Medicine. 2017; 9(4): 395 – 544.IF=9.547

[5]Wei-Jun W, Zhen-Kui S, Chen-Tian S, et al. Obatoclax and LY3009120 Efficiently Overcome Vemurafenib Resistance in Differentiated Thyroid Cancer. Theranostics 2017; 7(4): 987-1001. IF=8.854

[6]Chunlei Z, Kan W, Chao L, Yanlei L, Stress-induced cytotoxicity of chiral Agnanoclusters. J. Mater. Chem. B, 2014, 2, 6931–6938.

[7]Tianen Z, 1, Yanran L, 1, Longyuan J, et al. Mild hypothermia protects against oxygen glucosedeprivation/reoxygenation-induced apoptosis via the Wnt/b-catenin signaling pathway in hippocampal neurons. Biochemical and Biophysical Research Communications 2017, 03, 153.IF=2.371

[8]Dan Z, Xin-hui Z, Jian Z, Yun-xiao Z, et al. Propofol promotes cell apoptosis via inhibiting HOTAIR mediatedmTOR pathway in cervical cancer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2015, 468, 561-567.IF=2.371

[9]Yuan J, Mingxia D, Menghua W, Phosphatidic Acid Improves Reprogramming to Pluripotency by Reducing Apoptosis.STEM CELLS AND DEVELOPMENT, 2016, 25(1), 43-54.IF=3.777.

[10]Chunlei Z, Chao L,Yanlei L, et al. Gold Nanoclusters-Based Nanoprobes for Simultaneous Fluorescence Imaging and Targeted Photodynamic Therapy with Superior Penetration and Retention Behavior in Tumors. Adv. Funct. Mater. 2015, 25, 1314–1325.

[11]刘佳,李肖楠,孙思铭等.硫酸锌对血管内皮细胞氧化应激保护作用的研究.中国免疫学杂志.2017, 33(2),170-173.

价格比对:

常见问题：

Q:出现非特异性荧光标记？

1）组织/细胞本身核酶或聚合酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记，例如平滑肌细胞。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。

2）使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用新鲜配置的4%中性对聚甲醛固定液。

3）TUNEL检测反应时间过长，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。

Q:荧光背景很高？

1）高速分裂和增殖的细胞，转录水平高，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。

2）在激发光下长时间的暴露，导致假阳性的出现。

Q:标记效率低？

1）使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。

2）固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。

3）组织切片过厚，使得固定效果不理想，最好控制在10μm以内。

4）荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10min就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作。

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