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Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆试剂盒

—重组·高效·定向·快速

Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆技术基于DNA序列同源性进行片段重组，克服了传统克隆技术的众多缺陷，如受到酶切位点的限制，会附加多余碱基序列，操作过程十分繁琐，克隆效率低等。它可以将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆技术简便、快速、高效，是DNA无缝克隆的首选。

Hieff Clone^TM技术优势：

无需考虑酶切位点：不受插入DNA片段限制性酶切位点的限制，适用于任何载体。

设计简单：在插入片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。

快速高效：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

无缝克隆：插入位点不会引入额外的碱基序列。

Hieff Clone^TM实验流程：

Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆试剂盒分为单片段克隆和多片段克隆试剂盒，实验流程见下图1。

图1：Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆试剂盒进行单片段和多片段克隆实验流程图。

①线性化载体的制备：酶切或PCR制备线性化载体。②插入片段的制备：在目的DNA片段上下游引物的5’端引入20 bp左右末端同源序列；PCR反应扩增目的片段。③重组反应：按比例混合线性化载体和目的DNA片段进行重组，50℃反应20 min。④转化、涂板：将重组产物直接转化后涂平板。挑取克隆。

产品实例：

1.单片段高效重组

图2：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit可以有效克隆不同长度的单片段基因。A-D：重组转化平板。E：插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H：插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分别是1.2 kb，3 kb和5 kb，载体量：100 ng/20 μl反应体系，载体与插入片段摩尔比：1:3，反应条件：50℃，20 min。

2. 多片段轻松重组

图3：Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit进行三片段克隆。A：重组转化平板。B：插入片段和载体浓度检测电泳图。C：PCR方法鉴定每个单片段和最终连接基因。箭头指示目的条带。载体：pCAMIBA1302，10 kb，三个插入片段长度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，载体量：160 ng/20 μl反应体系，重组反应条件50℃，20 min。

3. 载体与插入片段摩尔比1:3左右最适

图4：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit进行单片段和载体不同摩尔浓度比例重组克隆测试。A-C：重组转化平板。载体与插入片段的分子摩尔数比分别是1:2（A），1:3（B）和1:4（C），重组反应条件50℃，20 min。

4. 重组反应时间20-30 min最佳

图5：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit进行不同重组反应时间克隆测试。A-C：重组转化平板。重组反应时间分别是20 min（A），25 min（B）和30 min（C），重组反应温度50℃。

客户案例展示：

1.超高的阳性率

客户单位：中国科学院植物生理生态研究所

图6：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit进行克隆，阳性率100%。A：重组转化平板。B：克隆基因PCR鉴定电泳图。载体：10 kb，插入片段：300 bp，载体浓度：50 ng/μl，插入片段浓度：50 ng/μl，载体与插入片段摩尔比例为1:1，重组反应条件50℃，20 min。

2.低浓度载体重组

客户单位：西南大学

图7：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit进行克隆。A：重组转化平板。B：载体浓度检测电泳图。C：插入片段浓度检测电泳图。D：克隆基因PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体4.7 kb，插入片段1.6 kb，载体浓度：5 ng/μl，插入片段浓度：25 ng/μl，载体与插入片段摩尔比例为1:2，重组反应条件50℃，20 min。

超高性价比

图8：Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit与不同品牌的同类产品相比，显示出更高的性价比。

FAQ

Q1：Hieff Clone^TM克隆的原理是什么？

A1： 利用末端同源重组的原理。将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。

Q2：与传统克隆相比，Hieff Clone^TM克隆有什么优势？

A2：1）无需考虑酶切位点：不受目的DNA片段限制性酶切位点的限制，适用于任何载体。

2）设计简单：在目的片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。

3）快速高效：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

4）无缝克隆：插入位点不会引入额外的碱基序列。

Q3：同源序列长度对重组效率的影响？

A3：同源序列的长度与克隆数目有相关性，一般同源片段选择在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范围内调整。并且选择尽量避免出现二级结构。

Q4：线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗？

A4：线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，建议割胶回收纯化产物。

Q5：一步法快速定向克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗？

A5：推荐使用转化效率为10⁸ cfu/μg的感受态细胞。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES），TOP10（cat NO. 11801ES）等。

Q6：线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例？

A6：载体使用量应大于0.01 pmol，推荐使用量0.03 pmol；克隆载体与目的片段摩尔比应在2:1-1:5范围内，最适为1:2-1:3，超过范围可能会影响克隆效率。

Q7：一步法快速定向克隆试剂盒适用实验有哪些？

A7：本试剂盒适用于绝大多数基于常规“酶切-连接”方法的克隆实验，并且特别适用于其它常规方法难以快速实现的基因多点突变、全基因合成等。

Q8：多片段一步法快速定向克隆试剂盒可以用于单片段的克隆吗？

A8：多片段一步法克隆试剂盒可以用于单片段的克隆。但是，单片段克隆试剂盒不建议用于多片段的克隆，重组效率可能会受到影响。

Q9：一步法快速定向克隆试剂盒反应温度是50℃，是否可以在37℃进行反应？

A9：一般情况下建议在50℃进行反应。50℃有利于消除DNA的二级结构，同时是Hieff Clone^TM重组酶的最适反应温度。37℃反应条件也可以进行重组反应，请根据实验需要进行优化。

订购信息

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关键词

无缝克隆；同源重组；Seamless；homologous recombination；多片段克隆。

产品发表文献

[1] Zhu T, Zhao Y, Wu Y, et al. The Staphylococcus epidermidis gdpS regulates biofilm formation independently of its protein-coding function[J]. Microb Pathog, 2017,105: 264–271. （皖南医学院）

[2] Li N, Hong T, Li R, et al. Cherry Valley Ducks Mitochondrial Antiviral-Signaling Protein-Mediated Signaling Pathway and Antiviral Activity Research[J]. Front Immunol, 2016,7:377. （山东农业大学）

公司介绍

上海翊圣生物科技有限公司（Yeasen biotech Co., Ltd.)成立于2009年，总部位于上海国际医学园区。翊圣生物立足于酶制剂生产，为分子诊断公司提供国际一流品质的酶制剂及相关原辅料。翊圣以酶制剂为基础研发新产品，目前产品主要面向分子诊断、科研和高通量建库相关领域。未来的产品将涉足食品安全和宠物疾病检测等领域。

研发团队

上海翊圣生物科技有限公司的主要研发人员来自国内一线科研院所：如中科院、上海交大、武汉大学、华东师范大学、厦门大学、上海师范大学和南京农业大学等。翊圣聘请组建了顶级的技术顾问团队，成员来自国内外一流大学，如耶鲁大学，加州伯克利、中科院大学等等，拥有丰富的科研经验以及外企工作的经历。优秀的人才是翊圣产品的品质保证，优秀的人才是翊圣的未来。

研发平台

翊圣生物不断开拓创新，通过蛋白分子结构的定向设计与大规模酶蛋白的突变筛选，为客户提供性能卓越的酶制剂产品。

翊圣建有四大蛋白重组表达体系，原核大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统以及哺乳动物细胞表达系统。公司有大规模的发酵系统和高通量的酶纯化系统，保证为客户提供大规模、高纯度和批次稳定的高品质原料。

翊圣产品是您分子诊断的品质保障。