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德国ChromoTek公司GFP trap和booster实验操作说明！北京乐博生物，优势代理！
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使用 GFP-Trap®_A ，GFP 融合蛋白如何进行免疫沉淀实验：
收集细胞：以下以一个免疫沉淀反应使用 ~ 106-107 的哺乳动物细胞 （约一个 10 厘米培养皿） 表达绿色荧光蛋白标记蛋白为例。收获贴壁细胞、 吸出生长培养基、 向培养皿中加入 1 毫升预冷 的 PBS ，并刮取细胞。细胞转移到一个预冷却的管子 ，在 500 g + 4°C 时的 离心 3 分钟并丢 弃上清液。用冰的 PBS 洗两次轻轻重新悬浮细胞块的细胞团。洗涤后进入下一步：
Lyse cells:（细胞裂解）
1、用移液器或使用注射器在 200 μ l 冰冷的裂解缓冲液重悬细胞颗粒。注意： 在裂解缓冲液中 加入蛋白酶抑制剂与 1 mM PMSF （用户自备）。对于核/染色质蛋白可采用以下方案： 使用 RIPA中加入 1mg/ml DNase, 2.5 mM MgCl2（自备）.
2、每充分吹打 10 分钟，把管子放置在冰上 30 分钟。
3、细胞裂解液 20.000 x g + 4 °C 离心 10 分钟。转移裂解产物到一个预冷管中。向裂解液中加入稀 释缓冲液 300ul。丢弃颗粒。
注意： 此时 细胞裂解液可以放在 -80 °C 进行长期储存。
可选： 向稀释缓冲中加入蛋白酶抑制剂与 1 mM PMSF （用户自备）。
Equilibrate beads（平衡 beads）
4、振荡混匀 GFP-Trap®_A beads，吸取 25 μ l bead 到 500 μ l 冰冷的稀释缓冲液中。离心 2.500 x g 2 分钟 + 4 °C。丢弃上清液和重复洗 2 次。
Bind proteins（结合蛋白）
5. 将步骤 3 得到的稀释的裂解液加入到步骤 4 得到的平衡的 GFP -Trap®_A beads 中。如果需要， 保存 50 ul 的稀释裂解液进行免疫印迹分析。 4°C 翻滚振荡 1 小时。
6. 2.500 x g + 4 °C 离心 2 分钟。如果需要，保存 50 ul 上清液进行免疫印迹分析。丢弃其余的上清液。
Wash beads （清洗 beads）
7.在 500 μ l 冰冷稀释缓冲液中重悬 GFP-Trap®_A beads。 在 2.500 x g + 4 °C 离心 2 分钟。丢弃 上清液和重复洗 2 次。
optional : Increase salt concentration in the second washing step up to 500 mM.
可选：在第二次洗的步骤中增加盐的浓度到 500 mM。
Elute proteins（洗脱蛋白）
方案一：用于 western blot（所有含 GFP 荧光标记的重组蛋白都会进行本步定量和鉴定实验）
8.在 100 μl 2x SDS -sample buffer 中重悬 GFP -Trap ®_A beads。
9. 煮沸重悬的 GFP -Trap® _A beads 在 95°C，10 min 条件下，把免疫复合物从绿色荧光蛋白中游 离出来。GFP -Trap®_A beads 能通过 2.500 x g 在 4 °C 离心 2 分钟进行收集，收集的产物上清 液可以进行 SDS –PAGE。
方案二：用于 western blot（所有含 GFP 荧光标记的重组蛋白都会进行本步定量和鉴定实验）
10. 替代步骤 8 和 9 的可选步骤： 洗脱绑定的蛋白加入 50 μl 0.2M 甘氨酸 pH 值 2.5 (孵育时间： 30 秒,恒定混匀）， 随后离心。转移上清液到新管中，为了中和添加 5 μl 1 M Tris（pH 值10.4）。为了提高洗脱效率可以重复这一步。
方案三：如需进行检测 GFP-融合酶的活性检测，无需洗脱单独，可以直接检测。
方案四：如要进行 CHIP 实验，主要用于含有 GFP 荧光的重组蛋白的蛋白质/DNA 相互作用的实验。 染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化，以及 DNA 的鉴定。其中第一步细胞固定，染色质断裂不变，染色质免疫沉淀，则直接进 入说明书的第 5 步，加入的是 DNA-蛋白复合物，结合到 GFP -Trap ®_A beads。进入第 6 步，第 7步，分离得到复合物；进入第 10 步，得到洗脱的复合物；后期交联反应的逆转，DNA 的纯化，以 及 DNA 的鉴定；同普通的 CHIP 实验。
方案五：pulldown 实验: 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互 作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。两个已知蛋白的相互作用：一个蛋白是 GFP 融 合蛋白，另一个蛋白为 FLAG 标签的融合蛋白；在第 5 步，同时加入两者，其他步骤不变。进入第 10 步，得到洗脱的复合物；同时进行 GFP 和 FLAG 的 western blot 实验。筛选与已知蛋白相互作 用的未知蛋白：操作同免疫沉淀法，第 10 步，得到洗脱的复合物，然后进行后期质谱检测。
方案五：Co-IP 实验: 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。用于验证两个已知蛋白的相互 作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。采用免疫沉淀，对象蛋白为 GFP-目的蛋白结合 的融合蛋白，与之相结合的蛋白质 Y 也被沉淀下来，从而达到吸附蛋白质-蛋白质复合物的目的。 沉淀下来的蛋白质复合物采用 SDS-Page 跑胶，western blot 进行鉴定，也可以选择用得到的样品利用质谱进行后续分析。
GFP Booster 实验操作：
1.固定： 接种于盖玻片的细胞用的 3.7%甲醛（溶于 PBS）固定，室温下 10 分钟。
2. 用含有 0.1%吐温 20 的 PBS (PBST)清洗样品三次。
3.穿透： 添加含 0.5%的 Triton X 100 （PBS）到样品并温育 5 分钟，室温下。或者通透细胞： 在 100%甲醇中温育样品 5 分钟（--20°C）。
4.用 PBST 清洗样品两次。
5.封闭： PBST 中添加 4 % BSA 加入到样品中，室温温育 10 分钟。
6. GFP-Booster 温育：在 blocking 缓冲液中加入 200 倍稀释的 GFP-Booster，室温温育 1 小时。
7.用 PBST 清洗样品三次，每次洗 5-10min。 8.如果需要的话，用 DNA 荧光染料染色（如 DAPI）。
9.安装：在水中快速冲洗样品，以防止盐晶体的形成。按照盖玻片。经荧光抗体染色的标本，需要 在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即作镜检，以防荧光消退，影响结果。
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