Cytoskeleton公司罗丹明标记的鬼笔环肽(Rhodamine phalloidin,货号PHDR1)现货促销！
产品名称：Rhodamine phalloidin 罗丹明标记的鬼笔环肽
产品货号：PHDR1
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背景描述：
鬼笔环肽是一种从鬼笔鹅膏中得到的有毒的环状七肽，可以与纤维肌动蛋白丝非常特异的结合，并且具有很高的亲和力。它能使肌动蛋白聚合物的临界浓度降低到小于1µg/mL，因此，常作为一种聚合促进剂使用。该物质可以被罗丹明染料标记，从而作为肌动蛋白抗体替代物广泛用于组织细胞培养、组织切片或无细胞系中的肌动蛋白标记。被罗丹明标记的肌动蛋白丝其生物学特性未发生改变（包括与肌球蛋白结合的能力）。
罗丹明标记的鬼笔环肽呈粉色，固体，分子量1306。其1 x 工作液即可对300-350张盖玻片的细胞进行染色。
注意：鬼笔环肽具有毒性，需小心操作（对人，其半数致死剂量为2mg/Kg）。
运输与保存方法：
室温运输。使用前简短离心使样品至管底，加入500µl无水甲醇配制成14um的溶液。推荐将其溶液分装成10×50µl份于-20℃避光保存，按照这种方法可稳定保存6个月，冻干产物可以在4℃干燥环境（湿度<10%）下保存1年。
产品应用：
应用1：免疫荧光
目前有多种方法可用于组织培养细胞中的微丝染色，而染色过程中固定是获得良好效果的关键步骤，根据不同的要求有不同的固定方法。用多聚甲醛或者戊二醛的方法固定可以取得较好的染色效果。
试剂
1） 罗丹明标记的鬼笔环肽；
2） 半丰度的3T3培养细胞；
3） F-肌动蛋白染色试剂盒（或按4-7配制溶液）；
4） 磷酸盐缓冲液（20mM,PH7.4,150mM NaCl）；
5） 固定液（3.7% 多聚甲醛溶于PBS，pH调制7.0）；
6） 透化液；
7） 抗荧光淬灭封片液（Fluka Biohemika, Cat.#10981）;
8） 100nM DAPI（溶于PBS）;
9） 载玻片；
10） 盖玻片封口液。
图1 经罗丹明鬼笔环肽标记的Swiss 3T3细胞中应力纤维图
备注：按照方法中的步骤利用Rhodamine phalloidin对生长于玻璃盖玻片上的半丰度的3T3细胞进行染色，利用带有480Ex/535Em设备的荧光显微镜进行观察（CCD摄像机，40倍目镜），明显可见被罗丹明鬼笔环肽染成红色的纤维蛋白丝和被DAPI染成蓝色的细胞核。
设备
1）荧光显微镜。
2）数字CCD照相机。
方法
1） 于盖玻片上培养组织细胞至半丰度；
2） 100nM Rhodamine phalloidin工作液的准备，即吸取3.5µl 14µM 的Rhodamine phalloidin的标记储存液于500µl PBS，室温避光保存。
3） 移除培养基，37℃下利用PBS轻轻洗涤培养细胞一次；
4） 利用固定液室温固定细胞10min。
5） PBS室温洗涤细胞30s；
6） 室温透化细胞5min；
7） PBS室温洗涤细胞30s；
8） 将盖玻片移至一张封口膜上，于潮湿的环境下加入200µl 100nM Rhodamine phalloidin，室温避光孵育30min。
9） PBS洗涤盖玻片3次；
10） 200µl 100nM DAPI复染DNA30s；
11） PBS冲洗盖玻片，翻转将其放置于滴有荧光猝灭液的载玻片上，用纸巾吸除多余液体；
12） 4 ℃避光保存上述载玻片；
13） 典型的F-肌动蛋白染色结果如图1。
应用2：稳定荧光微丝的制备
在肌球蛋白马达蛋白的研究中，稳定的微丝对于肌动蛋白的能动性分析是一个很好的底物。Rhodamine phalloidin的结合不会影响肌球蛋白ATP酶对肌动蛋白的激活作用。
试剂
1） 肌动蛋白（250µg）；
2） 常用肌动蛋白缓冲液(5mM Tris-HCl pH8.0, 0.2mM CaCl2)；
3） 10 x聚合缓冲液(100mM Tris pH7.5, 500mM KCl, 20mM MgCl2,10mM ATP;Cat.#BSA02)；
4） 罗丹明标记的鬼笔环肽。
设备
荧光显微镜；数字化CCD照相机。
方法
1） 配制具有0.2mM ATP 和1.0mM DTT的肌动蛋白缓冲液，取250µl重悬兔肌肉肌动蛋白。混匀，冰浴1h；
2) 加入1/10体积的聚合缓冲液室温聚合肌动蛋白1h；
3） 取2.5µl 14uM Rhodamine phalloidin于500µl聚合缓冲液中，混匀，利用该溶液100倍稀释聚合的微丝；
4） 滴1滴抗荧光猝封液于载玻片上，吸取1µl标记的肌动蛋白于上述抗荧光猝灭封片液中；
5） 盖上盖玻片，吸除多余液体；
6） 显微镜观察，微丝呈2-10µm的长度，4℃避光可以稳定保存一周。
产用使用
1）用于固定的组织切片、组织培养细胞中微丝的荧光染色。注意:不像一些肌动蛋白抗体，Rhodamine phalloidin仅与F肌动蛋白丝结合，从而降低了荧光背景。另外，该染料的结合没有物种差异。
2）体外稳定的荧光微丝的制备。
参考文献
1. Wµlf, E. et al. (1979). Proc Natl Acad Sci USA. 76(9):4498-4502.
2. Kron, S.J. et al. (1991). Meth. Enzmol. 196: 399-416.
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