来宝网 2011/7/29点击4344次
1、凝胶溶液的预处理
LH-20使用前必须溶胀，在溶胀过程中避免过度的搅拌，以免损坏其球形结构，请勿使用磁力搅拌器。
1、在室温下用过量的制备溶剂把LH-20充分溶胀至少三小时。
溶胀程度取决于使用溶剂的体系，下面的表格可用来计算定量的LH-20所需柱床的体积。
2、把定量的LH-20和溶剂制成沉淀体积：溶剂体积为3：1 混悬液，作为凝胶填充介质，此时可通过倾倒上层溶剂的方法除去较小粒径的LH-20.
第4页的表格给出了LH-20在不同有机溶剂中的溶胀柱体积（mL凝胶∕g干胶粉末）。
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溶剂（mL∕g干胶粉末） |
溶胀体积 |
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二甲基亚砜 |
4.4-4.6 |
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嘧啶 |
4.2-4.4 |
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水 |
4.0-4.4 |
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二甲基甲酰胺 |
4.0-4.4 |
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生理盐水 |
3.8-4.2 |
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甲醇 |
3.9-4.1 |
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二氯乙烷① |
3.8-4.1 |
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氯仿 |
3.8-4.1 |
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丙醇 |
3.7-4.0 |
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乙醇② |
3.6-3.9 |
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异丁醇 |
3.6-3.9 |
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甲酰胺 |
3.6-3.9 |
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二氯甲烷 |
3.6-3.9 |
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丁醇 |
3.5-3.8 |
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异丙醇 |
3.3-3.6 |
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四氢呋喃 |
3.3-3.6 |
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二恶烷 |
3.2-3.5 |
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丙酮 |
2.4-2.6 |
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乙腈③ |
2.2-2.4 |
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四氯化碳③ |
1.8-2.2 |
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苯③ |
1.6-2.0 |
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乙酸乙酯③ |
1.6-1.8 |
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甲苯③ |
1.5-1.6 |
①含1%甲醇
②含1%苯
③溶胀体积小于2.5mL∕g的干胶粉末体积时，通常不使用该类溶剂。
2、Sephadex LH-20的填装
1.所用凝胶需平衡至室温。
2.混匀并将凝胶混悬液保持连续摇晃倒入柱子中。倾斜玻璃棒沿着柱内壁搅拌以防止气泡的生成。加缓冲液至柱上端口。柱顶螺丝上紧后，将其与泵相连接。打开柱子的下出口。
3.打开柱子的底孔，以300cm∕h的流速填装使凝胶层析达到指定的高度。柱子填装时应在不使凝胶变形的压力下进行（柱子所能承受的压力是限制因素，是指定的最大填装压力）。停止泵的运行,关闭柱子的出口并将柱子移出架子。拧开螺丝并且将填料倒入水槽中。
4.在架子上重新装柱，小心加入缓冲液直到在柱子上口呈凸液面。
5.润湿滤网后用注射器抽出溶剂。将滤网倾斜插入柱子中，确保网下没有空气。调节滤网的O型环在柱壁形成滑动密封。
6.此时将所有管道连接。泵与柱子和柱子与样品应用系统之间必须形成无气泡的洗脱液连接。
3.柱平衡
在上样之前，平衡柱子时用洗脱液缓慢处理使基线趋于稳定（至少两个柱体积）。如果改变溶剂，应仔细注意新的溶剂凝胶的溶胀系数和滤网的重新定位。使用同一种洗脱液不必重新平衡。
4.洗脱液
为了确保柱子的长寿命，所有的缓冲液在使用之前都要采取离心式过滤或者通过耐溶剂过滤器（0.45μm 推荐仪器
