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ZORBAX 反相(PR) HPLC 色谱柱选择流程图

来宝网 2013/2/28点击2720次

 

适用于小分子和大分子
多数色谱工作者将反相液相色谱法作为他们的主要分析技术之一。反相液相色谱法可以用来分析离子型和非离子型的被分析物。因此,本 ZORBAX 色谱柱选择流程图将集中在反相色谱柱上。为了更容易的选择一款反相色谱柱进行小分子和大分子的方法开发,请遵循以下原则。

小分子、蛋白和多肽样品进行方法开发时,本流程图提供初始色谱柱选择的信息,也包括选择键合相和色谱柱规格。您也可以下载流程图 的PDF文件或 下载完整的Agilent ZORBAX 色谱柱选择指南

小分子
分子量< 2000
大分子
分子量>2000
80-120Å

填料孔径

300Å

基于需要分析的分子的大小选择最佳的填料孔径。通常,小分析可以容易地在标准 80-120Å 孔径的填料中扩散,但多肽和蛋白质可能不行。为了解决此问题,我们推荐使用300Å 孔径大小的填料(300SB),用于多肽和蛋白质的等度或梯度分离。

Eclipse Plus C18

启始色谱柱键合相

StableBond
300SB-C18

对于多数样品,一般推荐使用 C18 为启始色谱柱键合相,因为它能为中等极性到非极性的化合物提供最大的保留。如果使用 C18 键合相不能优化分离度或如果您正在分析较大的蛋白质时,应该考虑使用短链的键合相。
4.6 mm

色谱柱内径

4.6 mm

色谱柱内径决定了您可以进样的样品(样品量) —— 色谱柱内径越小,所需要的进样量越小,同时保持良好的峰形。较小内径的色谱柱具有较高的灵敏度,因此,常用于 LC/MS 分析和样品量受限的应用。

色谱柱类型

内径(mm)

上样量(约)

常规流速范围

提高灵敏度

应用

分析型

4.6

0.1-1.5 mg

0.5-3 mL/min

 

标准分离

溶剂节省柱

3.0

150-500 µg

0.3-1.5 mL/min

+

节省溶剂,用于标准 HPLC 仪器

窄径柱

2.1

50-120 µg

0.1-0.5 mL/min

++

高灵敏度、样品量受限、LC/MS、节省溶剂

微径柱

1.0

10-50 µg

10-100 µL/min

++++

高灵敏度、样品量受限、LC/MS

毛细管柱

0.5, 0.3

1-10 µg

1-15 µL/min

+++++

非常高的灵敏度、LC/MS、多肽和蛋白质

纳流柱

0.1, 0.075

100-200 ng

200-500 nL/min

++++++

非常高的灵敏度、LC/MS、多肽和蛋白质

半制备柱

9.4

1-10 mg

5-10 mL/min

 

mg 级制备分离

制备柱

21.2

20-250 mg

20-60 mL/min

 

几百毫克到 1

小分子
分子量< 2000
大分子
MW > 2000

5 µm

标准多孔填料粒径

5 µm

对小分子和大分子的常规分析,标准孔径为5 µm。尽管如此,我们提供了更小粒径的填料,具有更高柱效和更高的分离度。也提供含有此种填料的短柱。
快速分析填料粒径

快速分离 3.5 µm
快速分离高通量 1.8 µm

用于快速分离的 3.5µm 填料提供的柱效比 5 µm 填料高 60%;而用于快速分离高通量的 1.8 µm 填料提供的柱效比 5 µm 填料高 200%。采用更短的色谱柱能显著减少小分子化合物的分析时间。

快速分离 3.5 µm
Poroshell 5 µm

对于多肽,快速分离的 3.5 µm 填料可以与更短的色谱柱配合使用,实现更快速、高分离度的梯度分析。但是对于蛋白质,Poroshell 色谱柱(为实心核和多孔外层)提供了最快速的分析。

150 mm

色谱柱长度

150 mm

常规色谱柱长度为 150 mm 250 mm,装填了 5 µm填料,可以用于高分离度分离。这是种适宜于常规分析的启始色谱柱,因为他能在 20-30 分钟内提供较高的分离度。如需快速分析,应该使用更短的色谱柱(75 mm 50 mm)并填充更小粒径的填料(3.5 µm)。

对于蛋白质和多肽的消化,150 mm 也是一个良好的启始色谱柱长度。进行高分离度分析时,此长度的色谱柱一般梯度运行时间为 30-60 min。进行快速分析时,应该使用更短的色谱柱(50 mm)并填充更小粒径的填料(3.5 µm)。

启始色谱柱选择
小分子 大分子

常规分析

Eclipse Plus C18
4.6 x 150 mm, 5 µm
部件号 959993-902

快速分析

高分离度快速
Eclipse Plus C18
4.6 x 75 mm, 3.5 µm
部件号 959933-902

快速分离高通量
Eclipse Plus C18
4.6 x 50 mm, 1.8 µm
部件号 959941-902

常规分析

300SB-C18
4.6 x 150 mm, 5 µm
部件号 883995-902

快速分析

高分离度快速
300SB-C18
4.6 x 50 mm, 3.5 µm
部件号 865973-902

Poroshell
300SB-C18
2.1 x 75 mm, 5 µm
部件号 660750-902

如需其他方法开发指导, 请浏览 从低到高 pH 条件下的方法开发部分。

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