来宝网 2013/2/28点击2720次
适用于小分子和大分子
多数色谱工作者将反相液相色谱法作为他们的主要分析技术之一。反相液相色谱法可以用来分析离子型和非离子型的被分析物。因此,本 ZORBAX 色谱柱选择流程图将集中在反相色谱柱上。为了更容易的选择一款反相色谱柱进行小分子和大分子的方法开发,请遵循以下原则。
小分子、蛋白和多肽样品进行方法开发时,本流程图提供初始色谱柱选择的信息,也包括选择键合相和色谱柱规格。您也可以下载流程图 的PDF文件或 下载完整的Agilent ZORBAX 色谱柱选择指南。
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80-120Å |
填料孔径 |
300Å |
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基于需要分析的分子的大小选择最佳的填料孔径。通常,小分析可以容易地在标准 80-120Å 孔径的填料中扩散,但多肽和蛋白质可能不行。为了解决此问题,我们推荐使用300Å 孔径大小的填料(300SB),用于多肽和蛋白质的等度或梯度分离。 |
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Eclipse Plus C18 |
启始色谱柱键合相 |
StableBond |
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对于多数样品,一般推荐使用 C18 为启始色谱柱键合相,因为它能为中等极性到非极性的化合物提供最大的保留。如果使用 C18 键合相不能优化分离度或如果您正在分析较大的蛋白质时,应该考虑使用短链的键合相。 | ||||
4.6 mm |
色谱柱内径 |
4.6 mm |
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色谱柱内径决定了您可以进样的样品(样品量) —— 色谱柱内径越小,所需要的进样量越小,同时保持良好的峰形。较小内径的色谱柱具有较高的灵敏度,因此,常用于 LC/MS 分析和样品量受限的应用。 |
色谱柱类型 |
内径(mm) |
上样量(约) |
常规流速范围 |
提高灵敏度 |
应用 |
分析型 |
4.6 |
0.1-1.5 mg |
0.5-3 mL/min |
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标准分离 |
溶剂节省柱 |
3.0 |
150-500 µg |
0.3-1.5 mL/min |
+ |
节省溶剂,用于标准 HPLC 仪器 |
窄径柱 |
2.1 |
50-120 µg |
0.1-0.5 mL/min |
++ |
高灵敏度、样品量受限、LC/MS、节省溶剂 |
微径柱 |
1.0 |
10-50 µg |
10-100 µL/min |
++++ |
高灵敏度、样品量受限、LC/MS |
毛细管柱 |
0.5, 0.3 |
1-10 µg |
1-15 µL/min |
+++++ |
非常高的灵敏度、LC/MS、多肽和蛋白质 |
纳流柱 |
0.1, 0.075 |
100-200 ng |
200-500 nL/min |
++++++ |
非常高的灵敏度、LC/MS、多肽和蛋白质 |
半制备柱 |
9.4 |
1-10 mg |
5-10 mL/min |
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mg 级制备分离 |
制备柱 |
21.2 |
20-250 mg |
20-60 mL/min |
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几百毫克到 1 克 |
小分子 分子量< 2000 |
大分子 MW > 2000 |
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对小分子和大分子的常规分析,标准孔径为5 µm。尽管如此,我们提供了更小粒径的填料,具有更高柱效和更高的分离度。也提供含有此种填料的短柱。
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快速分析填料粒径 | ||||||
快速分离 3.5 µm 用于快速分离的 3.5µm 填料提供的柱效比 5 µm 填料高 60%;而用于快速分离高通量的 1.8 µm 填料提供的柱效比 5 µm 填料高 200%。采用更短的色谱柱能显著减少小分子化合物的分析时间。 |
快速分离 3.5 µm 对于多肽,快速分离的 3.5 µm 填料可以与更短的色谱柱配合使用,实现更快速、高分离度的梯度分析。但是对于蛋白质,Poroshell 色谱柱(为实心核和多孔外层)提供了最快速的分析。 |
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常规色谱柱长度为 150 mm 或 250 mm,装填了 5 µm填料,可以用于高分离度分离。这是种适宜于常规分析的启始色谱柱,因为他能在 20-30 分钟内提供较高的分离度。如需快速分析,应该使用更短的色谱柱(75 mm 和 50 mm)并填充更小粒径的填料(3.5 µm)。 |
对于蛋白质和多肽的消化,150 mm 也是一个良好的启始色谱柱长度。进行高分离度分析时,此长度的色谱柱一般梯度运行时间为 30-60 min。进行快速分析时,应该使用更短的色谱柱(50 mm)并填充更小粒径的填料(3.5 µm)。 |
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启始色谱柱选择 | ||||||
小分子 | 大分子 | |||||
常规分析 |
快速分析 快速分离高通量 |
常规分析 |
快速分析 Poroshell |
如需其他方法开发指导, 请浏览 从低到高 pH 条件下的方法开发部分。