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脂质过氧化检测试剂盒-衡量病理生理过程中氧化损伤的有用指标

脂质过氧化是一种多种脂质分子的非酶促氧化过程，涉及从碳原子上抽取氢原子并在通常与双键相邻的碳原子上插入氧分子。这会破坏脂质分子，导致如丙二醛（MDA）或4-羟基壬烯醛（HNE）等产物的形成。这些终产物可能作为信号分子发挥作用。检测脂质过氧化终产物是衡量病理生理过程中氧化损伤的有用指标。AkrivisBio的脂质过氧化检测提供了一种高效工具，通过与硫代巴比妥酸反应检测MDA，生成在532 nm处有吸收或荧光（激发/发射 = 532/553 nm）的生色团。

艾美捷脂质过氧化检测试剂盒：

货号：MA-0102

规格：100孔

样本类型：细胞或组织裂解液

适用范围：所有物种

检测方法：比色法，OD 532 nm；或荧光法，激发/发射 = 532/553 nm

检测类型：定量

应用：基于微孔板的比色/荧光检测，用于测定样本中的丙二醛（MDA）水平。

灵敏度：> 0.1 nmol/孔

储存条件：+4°C

运输温度：凝胶冰袋

有效期：自发货日期起一年

脂质过氧化检测试剂盒检测原理：

1. 破碎组织或细胞，沉淀蛋白。使用澄清的上清液进行分析。

2. 加入硫代巴比妥酸，在95°C孵育60分钟以形成生色团。

脂质过氧化检测试剂盒组成：

检测缓冲液：25 ml（WM MA-0102-A）

磷钨酸溶液：12.5 ml（NM MA-0102-B）

BHT：1 ml（紫色，MA-0102-C）

硫代巴比妥酸（TBA）：4 x 250 mg（NM MA-0102-D）

MDA标准品：100 ul（黄色，MA-0102-E）

用户自备试剂和设备：

冰醋酸

具有透明平底的96孔板

烤箱或热板

酶标仪

Eppendorf管或类似容器

储存和操作：

将试剂盒储存于4°C。使用前将所有试剂恢复至室温。打开前短暂离心试剂瓶。在进行检测前，请仔细阅读整个操作步骤。进行荧光检测时，请使用黑色或白色板。

试剂配制：

向一管硫代巴比妥酸中加入7.5 ml冰醋酸（用户自备），混合均匀。将浆液转移到另一管中，并加去离子水至最终体积25 ml。充分混合以溶解。如有必要，可超声以助溶解。配制好的溶液可在4°C下保存长达1周。

检测步骤：

1. 样本准备：

将10 mg组织或1×10⁶细胞在冰上用300 ul MDA裂解缓冲液+3 ul BHT进行匀浆。离心（13,000 X g，3-5分钟）以沉淀不溶性物质。或者，将样本在150 ul去离子水+3 ul BHT中匀浆以沉淀蛋白。加入150 ul 2 N高氯酸，涡旋，离心以去除蛋白。将200 ul上清液转移到微量离心管中。

对于血浆：在微量离心管中将20 ul血浆与500 ul 42 mM H₂SO₄（用户自备）混合。加入125 ul磷钨酸溶液，涡旋。静置5分钟，然后以13,000 x g离心1分钟。收集沉淀，并在冰上用100 ul去离子水+2 ul BHT重悬。用去离子水调整最终体积至200 ul。

2. 标准曲线准备：

用407 ul去离子水稀释10 ul MDA标准品，制备0.1 M MDA溶液。用980 ul去离子水稀释20 ul 0.1 M MDA溶液，制备2 mM MDA标准品。对于比色分析，将0、2、4、6、8、10 ul 2 mM MDA标准品分别加入不同的微量离心管中，并用去离子水调整体积至200 ul。对于荧光分析，将2 mM MDA标准品稀释10倍（10 ul + 90 ul去离子水）。将0、2、4、6、8、10 ul 0.2 mM MDA标准品分别加入不同的微量离心管中，并用去离子水调整体积至200 ul。

3. 显色反应：

向含有标准品或样本的每个试管中加入600 ul TBA试剂。在95°C下孵育60分钟以完成显色反应。在冰浴中冷却至室温10分钟。从每个反应混合物中取200 ul加入96孔微孔板进行分析。标准曲线范围：比色法：0 5 nmol；荧光法：0 0.5 nmol MDA。对于血浆：与300 ul正丁醇和100 ul 5 M NaCl混合；涡旋；离心（3分钟，16,000g，室温）；将正丁醇（上层）转移到新的离心管中，并使用热（55°C）和/或真空蒸发正丁醇。将剩余物质在200 ul去离子水中重悬。充分混合后，加入200 ul至96孔黑色板中。

偶尔，样本会出现浑浊，可以使用0.2 um滤膜去除。TBA会与样本中的其他化合物反应生成其他有色化合物。这些化合物通常不会干扰TBA-MDA加合物的定量。

注意：为了提高灵敏度，向800 ul反应混合物中加入300 ul正丁醇（用户自备），以提取生色团。如果没有分层，加入100 ul 5 M NaCl并剧烈涡旋。通过离心（3分钟，16,000g，室温）分离各层。转移并蒸发正丁醇，将生色团溶解在200 ul去离子水中，然后在96孔微孔板中读取。

4. 测量：

对于比色分析，读取532 nm处的吸光度。

对于荧光分析，使用激发/发射 = 532/553 nm读取上清液。

5. 计算：

从所有读数中减去0 MDA标准品的值。绘制MDA标准曲线。斜率定义了OD/nmol。将斜率应用于背景校正后的样本读数。对样本值进行校正，以考虑样本制备过程中进行的任何其他稀释。

样本羟脯氨酸浓度 = [(A/(mg或ml)] x 4 x D = nmol/ml或nmol/mg

其中：A：从标准曲线上得到的样本中MDA的量（以nmol计）。

mg：使用的原始组织量

ml：使用的原始血浆体积

4：使用800 ul反应混合物中的200 ul进行校正

D：稀释因子（用于准备原始样本）

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羟脯氨酸测定试剂盒-检测蛋白质和组织水解产物中的羟脯氨酸

羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一种非必需亚氨基酸，主要存在于动物的胶原蛋白和弹性蛋白中。在植物细胞壁中，富含羟脯氨酸的蛋白质被用作糖链的附着点。羟脯氨酸在胶原蛋白中通过增强其机械稳定性发挥功能。在疾病状态下（如肝纤维化、佩吉特病、骨转移等），通过测量水解产物或血清和尿液中的羟脯氨酸水平，可以评估胶原蛋白的形成和代谢。

AkrivisBio的羟脯氨酸检测试剂盒主要用于检测蛋白质和组织水解产物中的羟脯氨酸。血清和尿液经过适当预处理后也可作为检测样本。该试剂盒提供了一种简单的羟脯氨酸测量方法，生成的显色剂可在550-565纳米波长范围内测量，适用于1-20微克胶原蛋白或约0.1-2微克羟脯氨酸的检测。

艾美捷羟脯氨酸测定试剂盒#MA-0101检测原理：

1.样本在酸中彻底水解。

2.羟脯氨酸被氯胺T氧化为吡咯。

3.吡咯随后与艾氏试剂（Ehrlich’sReagent）反应生成显色物质。

检测试剂：

-氧化缓冲液：10毫升

-氯胺T浓缩液：0.6毫升

-酸/异丙醇溶液：5毫升

-DMAB浓缩液：5毫升

-羟脯氨酸标准品（1毫克/毫升）：0.1毫升

-微孔板封口膜：1张

用户自备试剂和设备：

-12摩尔/升盐酸

-96孔透明平底板

-烤箱或热板

-聚丙烯试管

储存和处理：

将试剂盒储存于+4°C。使用前短暂离心小瓶。阅读完整协议后再进行检测。

-氯胺T试剂：每孔加入6微升氯胺T浓缩液至94微升氧化缓冲液中，混合均匀。

-DMAB试剂：每孔加入50微升DMAB浓缩液至50微升酸/异丙醇溶液中，混合均匀。

-注意：为获得最佳结果，建议在2-3小时内使用稀释后的试剂。

检测步骤：

1.样本准备：将样本用100微升去离子水/10毫克组织匀浆化。在耐压试管（如Nalgene微型试管）中加入等体积浓盐酸（约12N，未提供），混合均匀后在120°C下水解3小时。尿液样本也用等体积浓盐酸处理并同样水解。之后，尿液样本需用活性炭（1毫克/50微升尿液/盐酸混合物）处理，离心3分钟以去除活性炭。将每个水解后的样本10微升转移到96孔板中，并在热源和/或真空中蒸发至干燥。

-注意：内源性化合物可能干扰反应。为确保准确测定样本中的羟脯氨酸，建议向样本中加入已知量的标准品（0.4微克）。

2.标准曲线：将羟脯氨酸标准品稀释至40微克/毫升，方法是将10微升1毫克/毫升的标准品加入240微升去离子水中，混合均匀。将0、5、10、15、20、25微升分别加入一系列孔中，每种浓度双孔。这将得到一个0-0.2-0.4-0.6-0.8-1微克/孔的标准曲线。

3.氧化反应：向每个样本和标准品孔中加入100微升氯胺T试剂，室温下氧化反应5分钟。

4.显色反应：向每个孔中加入100微升DMAB试剂，盖上孔板封口膜，在60°C下反应30-40分钟，使颜色完全显色。

-注意：氯胺T试剂和DMAB试剂密度差异大，不易混合。封板前，每个孔上下吸打2-3次以混合均匀。显色反应在约30分钟时达到最大值。如果反应时间过长，颜色会褪去。颜色在室温下可保持稳定。

5.测量：在560纳米处测量吸光度。

6.计算：从所有读数中减去0微克羟脯氨酸标准品的吸光度值。绘制标准曲线。曲线的斜率定义了系统的灵敏度。将背景校正后的样本读数除以标准曲线的斜率，以确定测试孔中的羟脯氨酸量。通过以下步骤推算回原始样本中的量：

-A.将孔中的羟脯氨酸量除以加入孔中的样本体积（微升）=样本中羟脯氨酸/样本微升

-B.将样本中羟脯氨酸/样本微升乘以1中样本的总体积=样本中总羟脯氨酸

-C.将样本中总羟脯氨酸乘以处理过程中产生的任何稀释因子。

-D.将样本中总羟脯氨酸除以处理前的组织毫克数或液体样本体积=样本中羟脯氨酸/组织毫克等。

-注意：许多代谢物和其他化学物质可能会显著干扰各种反应化学。为了更精确的测定，在没有样本和有恒定量样本的情况下进行标准曲线。没有必要运行所有六个标准；使用最少的3个（0-10-20微升）来验证吸光度响应是否与分析物量呈线性关系。两个标准曲线的斜率应该相同。它们之间的吸光度偏差归因于样本中的分析物量（当前情况下的羟脯氨酸）。如果两个斜率不同，则存在矩阵效应影响反应化学。在这种情况下，确定0标准之间的吸光度差异，并将其应用于在样本存在的情况下运行的标准曲线的斜率。

具有大矩阵效应的样品示例（右图）：

0标准之间的差异为0.35。在样本存在的情况下，斜率为0.226吸光度/微克。具有基质效应的样本中羟脯氨酸的量为0.35吸光度/0.226吸光度/微克 = 1.55微克。

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细胞衰老染色试剂盒-用于在光学显微镜下检测衰老细胞中的β-Gal活性

细胞衰老是指细胞停止分裂的现象。

细胞衰老可以由内部因素（氧化应激、DNA损伤等）和外部因素（毒素、紫外线等）诱导。衰老是一种细胞生长停滞的状态，细胞保持活性但不再分裂。衰老细胞表现出细胞体积增大、衰老相关β-半乳糖苷酶（β-Gal）表达增加、p53和p16活性增强，以及基因表达模式的改变。AkrivisBio的衰老检测试剂盒旨在检测β-Gal活性。β-Gal主要存在于衰老细胞中，但在正常表达β-Gal的细胞（如成熟巨噬细胞）中可能会出现假阳性。

艾美捷细胞衰老染色试剂盒：

货号：COS-0102

规格：可用于染色4片24孔、12孔或6孔培养板

样本类型：培养的贴壁细胞

适用物种：所有

检测方法：光学显微镜

检测类型：定性检测

应用：用于在光学显微镜下检测衰老细胞中的β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性。

储存条件：4°C

运输温度：冰凝胶包运输

保质期：自发货之日起一年

检测原理：

1.细胞被固定以使其变得通透。

2.细胞经过一夜染色，以便在显微镜下观察到蓝色。

检测试剂：

-固定液：125毫升

-X-gal（150毫克）：冻干粉，绿色试剂瓶

-染色液：125毫升

-染色补充液：1.5毫升

用户自备材料：

-N,N-二甲基甲酰胺（DMF）

-磷酸盐缓冲液（PBS）

储存和处理：

-将试剂盒储存于-20°C。溶解X-gal后，将溶液储存于-20°C并避光。

-以下协议是为12孔板的每个孔设计的。如果使用不同规格的孔板，请相应调整体积（例如，对于6孔板，体积加倍；对于24孔板，体积减半）。

-准备PBS溶液（未提供），每孔3毫升。

-X-gal溶液：X-gal具有吸湿性。在打开瓶盖前，让其在室温下平衡30分钟。称取20毫克X-gal放入棕色或用铝箔包裹的试管中，加入1毫升N,N-二甲基甲酰胺，制备20倍浓缩液。未使用的X-gal溶液可在-20°C（避光）下储存1-2个月。始终使用聚丙烯或玻璃容器存放X-gal溶液，不要使用聚苯乙烯。

-固定液、染色液和染色补充液（100倍浓缩）可在4°C下储存。

-如果染色液或染色补充液中出现沉淀，将溶液加热至37°C以重新溶解沉淀。如果沉淀仍然存在，离心试管并使用上清液。

衰老检测步骤：

1.通过在孔边缘吸液移除培养基，用1毫升PBS洗涤细胞一次。

2.用0.5毫升固定液在室温下固定细胞10-15分钟。在细胞固定的同时准备染色液。根据要染色的孔数准备足够的溶液。对于每个孔，准备以下溶液：

-染色液：470微升

-染色补充液：5微升

-X-gal在DMF中的溶液：25微升

3.用1毫升PBS洗涤细胞两次。

4.向每个孔中加入0.5毫升染色液混合物。盖上孔板。在37°C下孵育过夜。

5.在显微镜下观察细胞蓝色的出现（放大倍数为40-400倍）。

6.对于长期保存染色后的孔板，移除染色液并加入70%甘油至细胞中。在4°C下保存。

示例：

X-gal染色的典型结果。  

出处：Tominaga, T., Shimada, R., Okada, Y., Kawamata, T., & Kibayashi, K. (2019). 鼠脑创伤后大脑中衰老相关β-半乳糖苷酶染色。《PLOS ONE》，14(3)，e0213673。doi:10.1371/journal.pone.0213673

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活细胞与死细胞区分染色试剂盒：对活细胞进行染色，区分活细胞和死细胞

区分活细胞和死细胞是在研究细胞生长调控机制以及细胞死亡机制和途径时常见且非常重要的任务。  

AkrivisBio的即用型试剂让这一过程变得简单。我们结合了一种专有的细胞可渗透的绿色荧光染料来染色活细胞，以及一种红色非渗透性染料——碘化丙啶（propidium iodide），用于染色所有细胞。染色后的细胞可以通过荧光显微镜进行观察。试剂盒提供了足够用于4片24孔板的材料。

艾美捷活细胞与死细胞区分染色试剂盒：

货号：COS-0103

规格：包含用于染色4片24孔板的试剂。

样本类型：贴壁细胞或悬浮细胞

适用物种：所有

检测方法：荧光显微镜

检测类型：定性检测

应用：用于对活细胞进行染色，以便在荧光显微镜下方便地区分活细胞和死细胞。

储存条件：-20°C

运输温度：冰凝胶包运输

保质期：自发货之日起一年

活细胞与死细胞区分染色试剂盒成分：

-活细胞染料：50微升，绿色（COS-0103-A）  

-全细胞染料：50微升，红色（碘化丙啶，COS-0103-B）  

-染色缓冲液：50毫升（COS-0103-C）  

储存和稳定性：

未开封的试剂盒应储存于-20°C。染色缓冲液和全细胞染料（碘化丙啶）开封后可在4°C下储存。活细胞染料应始终储存于-20°C。

染色步骤：

1. 根据要染色的孔数准备足够的染色液。每个孔需要0.5微升活细胞染料、0.5微升全细胞染料和0.5毫升染色缓冲液。根据实验规模相应调整体积。  

2. 通过轻柔离心（500×g，5分钟）收集细胞（10⁶个）。移除并丢弃上清液。  

3. 加入500微升染色液，轻轻重悬细胞沉淀。  

4. 在37°C下孵育15分钟。  

5. 将细胞悬液转移到载玻片上，并用盖玻片覆盖细胞悬液。放置在显微镜载物台上进行观察。  

注意：对于贴壁细胞，可以直接在盖玻片上培养。染色时，倾斜并移除培养基，然后放平，加入0.5毫升染色液并孵育15分钟。将盖玻片倒置在载玻片上，放置在显微镜载物台上。  

6. 使用能够检测荧光素和罗丹明的带通滤光片（排除较短波长）的荧光显微镜立即观察细胞。  

-活细胞会被细胞可渗透的活细胞染料染成绿色荧光（激发波长488纳米；发射波长518纳米）。  

-死细胞染料会将活细胞和死细胞都染成红色（激发波长488纳米；发射波长615纳米），从而呈现出黄色-红色的混合外观。  

注意：不同细胞类型的染色条件有所不同，因此需要手动调整条件以找到两种染料的合适浓度。碘化丙啶是一种疑似致癌物，操作时需格外小心。

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镍比色测定试剂盒--定量检测多种样本类型中的Ni²

镍是地壳中最为常见的金属元素之一，仅次于铁。  

许多酶利用镍作为活性位点的一部分，包括单核（如甘油醛酶I、超氧化物歧化酶）、双核（如脲酶）或更复杂的异核簇（如几种氢化酶和脱氢酶）。我们利用镍与含有巯基的化合物形成络合物的能力，这些化合物在紫外/可见光区域具有吸收带。AkrivisBio的镍检测试剂盒是一种简单、灵敏的方法，可用于定量检测多种样本类型中的Ni²⁺。由于其他离子也表现出与含硫化学物质相似的行为，因此采用差分吸光度法来校正干扰物质。

艾美捷镍比色测定试剂盒：

货号：MA-0134

规格：100孔

样本类型：包括细胞和组织培养上清液、尿液、血浆、血清以及许多其他生物液体在内的多种样本。

检测方法：比色法，吸光度330纳米和405纳米

检测类型：定量检测

应用：一种基于微孔板的简单、灵敏的比色法检测方法，用于在多种样本中定量检测Ni²⁺，线性检测范围为样本中2-50纳摩尔镍。

灵敏度：样本中镍的线性检测范围为2-50纳摩尔。

储存条件：室温

运输温度：室温

保质期：自发货之日起一年

镍比色测定试剂盒检测原理：

在硼酸盐缓冲液中，镍与巯基乙醇形成络合物，在330纳米处产生强烈的吸收带。如果存在铁和/或钴，它们也会在330纳米和405纳米处表现出差分吸收，这些吸收用于校正它们的影响。镁、铜和锌不会产生干扰。

检测试剂：

-检测缓冲液：20毫升  

-镍试剂：1毫升（绿色）  

-氯化镍：1毫升（黄色）  

储存和处理：

-检测缓冲液和镍试剂：即用型，室温保存。  

-镍标准品：以1毫摩尔/升溶液形式提供，即用型，室温保存。

检测步骤：

1. 标准曲线：在96孔板的一系列孔中分别加入0、10、20、30、40、50微升镍标准品。用检测缓冲液将所有孔的体积调整至200微升。标准品浓度分别为0、10、20、30、40、50纳摩尔镍。

2. 样本准备：镍的浓度可能变化范围较广。加入10-100微升每个样本，并用检测缓冲液将所有测试孔的体积调整至200微升。样本读数应位于标准曲线范围内。如果任何样本超出该范围，适当稀释并重新检测。  

注意：如果样本中没有或极少含有铁或钴污染，只需在405纳米处读取吸光度。如果样本中预期含有铁或钴，需在加入镍试剂之前和之后，分别在330纳米和405纳米处读取样本吸光度。

3. 读取1：在加入镍试剂之前，读取样本和标准品在330纳米和405纳米处的吸光度。任何吸光度仅由Fe²⁺和/或试剂背景引起。将这些测量值分别记作OD3301和OD4051。

4. 络合物形成：向所有标准品和样本孔中加入10微升镍试剂，允许30分钟用于络合物形成和颜色发展。

5. 读取2：再次读取所有样本和标准品在330纳米和405纳米处的吸光度。将这些测量值分别记作OD3302和OD4052。

6. 在没有铁或钴离子的情况下测定镍：从405纳米处的读取2（OD4052）中减去405纳米处的读取1（OD4051）。绘制标准曲线。确定标准曲线的斜率（OD/纳摩尔）。将样本的ΔOD405（OD4052 - OD4051）除以标准曲线的斜率，以确定镍的纳摩尔数。

7. 在存在铁和/或钴的情况下测定镍：从所有标准品和样本读数中减去0镍的OD读数。

- a. 校正330纳米处因铁引起的干扰：在没有巯基乙醇的情况下，330纳米处的吸光度（OD3301）仅由Fe²⁺贡献。加入含有巯基乙醇的镍试剂后，Fe²⁺对OD3302的贡献按以下方式计算：计算OD3302 = 1.82 × OD3301。从总测量的OD3302中减去因铁导致的计算OD3302值，以获得因镍和钴导致的校正OD330。

- b. 校正405纳米处因铁引起的干扰：在没有巯基乙醇的情况下，405纳米处的吸光度（OD4051）仅由铁贡献。加入含有巯基乙醇的镍试剂后，铁对OD4052的贡献可以按以下方式计算：计算OD4052 = 1.65 × OD4051。从总测量的OD4052读数中减去因铁导致的计算OD4052值，以获得仅因镍和钴导致的校正OD405读数。

- c. 校正因钴导致的干扰：计算校正后的OD330和OD405的比值 =（校正后的OD330/校正后的OD405）。该比值将从100%钴贡献吸光度时的0.925变化到100%镍贡献时的2.8125。从校正后的读数比值中减去0.925，并将该结果除以1.8875，{[（OD330/OD405）- 0.925)]/1.8875}。这就是因镍导致的吸光度百分比。将该百分比乘以校正后的OD330，以获得样本中OD3302处的孤立镍吸光度。

8.计算：绘制标准曲线（ΔOD405或ΔOD330）。确定标准曲线的斜率。计算步骤6中没有铁或钴的样本的样本镍读数ΔOD405，或步骤7中有铁和/或钴干扰的样本的校正OD330。将校正后的样本镍读数除以标准曲线的斜率，以确定孔中镍的纳摩尔数。

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琥珀酸测定试剂盒--准确测定低于25微摩尔的琥珀酸

琥珀酸是三羧酸循环中的一个重要代谢产物。  

它处于一个关键节点，提供FADH₂，从而将电子引入细胞呼吸过程中的电子传递链。琥珀酸由乙酰辅酶A和草酰乙酸通过柠檬酸合酶生成，并在生成FADH₂的过程中转化为延胡索酸。琥珀酸还作为一种信号分子，参与多种细胞过程，包括炎症、缺氧反应和基因表达调控。在缺血等病理条件下，琥珀酸会积累，损害线粒体功能，并促进氧化应激和组织损伤。AkrivisBio的琥珀酸检测法是一种简单、灵敏的定量检测方法，能够准确测定低于25微摩尔的琥珀酸。

艾美捷琥珀酸测定试剂盒：

货号：MA-0134

规格：100孔

样本类型：细胞裂解液、组织提取物

适用物种：所有

检测方法：比色法，吸光度450纳米

检测类型：定量检测

应用：一种基于微孔板的比色法检测方法，用于在多种样本类型中定量检测低于25微摩尔的琥珀酸。

灵敏度：低于25微摩尔

储存条件：-20°C

运输温度：冰凝胶包运输

保质期：自发货之日起一年

琥珀酸测定试剂盒检测原理：

1.在ATP和辅酶A存在的情况下，琥珀酰辅酶A合成酶将琥珀酸转化为琥珀酰辅酶A，同时生成ADP。  

2.己糖激酶利用ADP将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸。  

3.葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化，将NAD转化为NADH。  

4. NADH用于还原四氮唑，生成具有最大吸收波长为450纳米的高色素甲臜。

检测试剂：

-检测缓冲液：25毫升  

-琥珀酰辅酶A合成酶：冻干粉，紫色试剂瓶  

-己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶：冻干粉，绿色试剂瓶  

- ATP/辅酶A/葡萄糖：冻干粉，蓝色试剂瓶  

- WST-8试剂：冻干粉，红色试剂瓶  

-琥珀酸标准品：冻干粉，黄色试剂瓶  

储存和处理：

使用前储存于-20°C。使用前将检测缓冲液恢复至室温。打开前将所有小瓶短暂离心数秒。  

-检测缓冲液：即用型，储存于-20°C。  

-琥珀酰辅酶A合成酶、己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、ATP/辅酶A/葡萄糖：用220微升检测缓冲液溶解。如果检测需要多次使用，可分装成小份量并储存于-20°C。使用时置于冰上。  

- WST-8试剂：用220微升去离子水溶解。储存于-20°C。  

-琥珀酸标准品：用100微升水溶解，得到40毫摩尔/升溶液。储存于-20°C。使用时置于冰上。

检测步骤：

1. 将微孔板读取器预热至37°C。  

2. 标准曲线：将10微升标准品转移至990微升去离子水中，得到0.4毫摩尔/升溶液。将0、5、10、15、20、25微升的标准溶液分别转移至96孔板的一系列孔中，分别得到0、2、4、6、8、10纳摩尔琥珀酸。用琥珀酸检测缓冲液将所有孔的体积调整至50微升。  

3. 样本准备：将组织（10毫克）或细胞（10⁶个）直接在100微升检测缓冲液中匀浆化。以16,000×g离心以去除颗粒物。将清亮的上清液转移至新的试管中。将每个样本的5-50微升转移至96孔板，并用检测缓冲液将所有孔的体积调整至50微升。  

注意：  

a. 该反应涉及辅酶A。涉及辅酶A的反应表现出辅酶A酯的非酶促水解，导致无效循环，从而产生较高的背景漂移。所有样本和标准品将以相同的速率漂移，从含有琥珀酸的样本中减去0标准和/或背景对照可以校正背景漂移。  

b. 样本中的NADH会产生背景。将此类样本双份运行，使用配对孔作为背景对照。  

c. 使用1%（重量/体积）聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）对有色样本（例如葡萄酒）进行脱色处理。孵育5分钟，然后通过10千道尔顿离心过滤器过滤。  

4. 启动反应：根据要检测的样本和标准品数量准备足够的反应混合液。每个孔需要50微升反应混合液，包含以下成分：  

- 反应混合液：检测缓冲液42微升，琥珀酰辅酶A合成酶2微升，己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶2微升，ATP/辅酶A/葡萄糖2微升，WST-8试剂2微升。  

- 背景对照混合液：检测缓冲液44微升，己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶2微升，ATP/辅酶A/葡萄糖2微升，WST-8试剂2微升。  

将50微升反应混合液加入含有标准品和样本的每个孔中，混合均匀。  

5. 测量：在37°C下，用微孔板读取器在450纳米处监测反应30-60分钟，直到所有孔的吸光度平行漂移。  

6. 典型结果  

7. 计算：从所有标准品读数中减去0标准品读数。绘制标准曲线并确定标准曲线的斜率。该斜率定义了测量系统的吸光度/纳摩尔。如果运行了背景对照，则从配对样本中减去这些值，否则从0标准品的背景值中减去。将校正背景后的样本值除以标准曲线的斜率，以获得样本孔中琥珀酸的纳摩尔数。要将结果换算回每单位样本中的琥珀酸纳摩尔数：  

- A. 将样本孔中的琥珀酸纳摩尔数除以加入孔中的样本微升数 = 样本中琥珀酸纳摩尔/微升。  

- B. 将样本中琥珀酸纳摩尔/微升乘以离心步骤后新鲜试管中超氧化物歧化酶的总体积 = 样本中琥珀酸的总纳摩尔数。  

- C. 将样本中琥珀酸的总纳摩尔数除以组织毫克数（或细胞数量等） = 每毫克组织（或细胞数量等）中的琥珀酸纳摩尔数。

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谷胱甘肽过氧化物酶活性测定试剂盒检测步骤和结果分析

谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）是一种帮助维持氧化还原平衡并抵御氧化应激的酶。GPx催化还原H₂O₂和有机氢过氧化物，以谷胱甘肽作为辅底物，防止活性氧（ROS）的积累，从而避免对蛋白质、脂质和DNA造成损伤。GPx广泛分布，尤其在代谢活跃的器官（如肝脏、肾脏、肺部和红细胞）中含量丰富。其表达水平受环境因素调节，包括饮食中的硒和氧化应激水平。GPx缺乏与多种病理状况相关，包括神经退行性疾病、心血管疾病、癌症和年龄相关性黄斑变性。AkrivisBio的谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒是一种简单、灵敏的检测方法，能够评估多种样本中的GPx活性，灵敏度低于每孔0.2毫单位。

艾美捷谷胱甘肽过氧化物酶活性测定试剂盒：

货号：MA-0137

规格：100孔

样本类型：组织提取物、细胞裂解液、血清、尿液、血浆及其他生物液体

适用物种：所有

检测方法：比色法，吸光度450纳米

检测类型：定量检测

应用：一种基于微孔板的比色法检测方法，用于在多种样本中测量谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性，灵敏度低于每孔0.2毫单位。

灵敏度：低于0.2毫单位/孔

储存条件：-20°C

运输温度：冰凝胶包运输

保质期：自发货之日起一年

谷胱甘肽过氧化物酶活性测定试剂盒检测原理：

1.在还原型谷胱甘肽存在的情况下，GPx还原添加的枯烯氢过氧化物，过程中生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）。

2.谷胱甘肽还原酶将GSSG还原回谷胱甘肽的还原型（GSH），同时将NADPH转化为NADP。

3.通过在340纳米处监测反应，直接跟踪NADPH的减少。

检测试剂：

-检测缓冲液：50毫升（MA-0137A）

-NADPH：冻干粉，蓝色试剂瓶（MA-0137B）

-谷胱甘肽还原酶：2微升，绿色试剂瓶（MA-0137C）

-还原型谷胱甘肽（GSH）：冻干粉，琥珀色试剂瓶（MA-0137D）

-枯烯氢过氧化物：2微升，黄色试剂瓶（MA-0137E）

-GPx阳性对照：冻干粉，红色试剂瓶（MA-0137F）

储存和处理：

未开封的试剂盒应储存于-20°C。使用前将检测缓冲液恢复至室温。打开前将所有小瓶短暂离心数秒。

-检测缓冲液：即用型，储存于4°C。

-NADPH：用0.5毫升去离子水溶解。储存于-20°C。

-谷胱甘肽还原酶：用220微升检测缓冲液溶解。使用时置于冰上。储存于-20°C。

-还原型谷胱甘肽：用220微升检测缓冲液溶解。使用时置于冰上。储存于-20°C。

-枯烯氢过氧化物：用1.25毫升检测缓冲液溶解。储存于4°C。

-谷胱甘肽过氧化物酶阳性对照：用100微升检测缓冲液溶解。使用时置于冰上。储存于-20°C。

-在使用过程中，所有含有酶的物质（样本、谷胱甘肽还原酶、GPx阳性对照）应置于冰上。

检测步骤：

1.标准曲线：将25微升NADPH溶液转移至975微升去离子水中，得到1毫摩尔/升NADPH溶液。将0、20、40、60、80、100微升的1毫摩尔/升NADPH溶液分别加入96孔板中，分别得到0、20、40、60、80、100纳摩尔。用检测缓冲液将所有孔的体积调整至100微升。在340纳米处测量吸光度，绘制标准曲线。

2.样本准备：在冰上将组织（10毫克）、细胞（10⁶个）或红细胞（100微升沉淀）在100微升检测缓冲液中匀浆化。在4°C下以16,000×g离心5分钟；将清亮的上清液转移至新的试管中并置于冰上。直接将血清转移至孔中。将样本的2-50微升转移至96孔板的孔中。用检测缓冲液将所有孔的体积调整至50微升。

注意：NADPH不稳定，容易被多种酶降解。未立即分析的样本应储存于-80°C或更低温度。所有样本读数必须落在标准曲线范围内。任何低于约0.3-0.4吸光度的样本读数都可能处于非线性范围内，应稀释后重新检测。

3.阳性对照和背景对照：将5微升GPx阳性对照转移至一个孔中，并用检测缓冲液调整至50微升。将50微升检测缓冲液转移至一个孔中作为背景对照，以校正可能发生的任何非GPx导致的NADPH损失。

4.准备反应：每个反应需要40微升预反应混合液。

5.启动反应：向测试样本和阳性对照（不要向背景对照孔）中加入10微升枯烯氢过氧化物以启动反应。

6.测量：在25°C下，在340纳米处动力学监测反应，时间足够长以建立反应的线性速率。

注意：在加入枯烯氢过氧化物之前，测试和阳性对照孔在15分钟预孵育后的初始340纳米吸光度应大于1.0。如果读数小于1.0，意味着样本中要么GPx含量过高（稀释后重新检测），要么GSSG含量过高。可以通过使用10千道尔顿离心过滤器从样本中去除小分子来减少高GSSG。

7.典型结果：

8.计算：从所有标准品中减去0标准品的值。绘制标准曲线。确定标准曲线的斜率。确定背景对照和测试孔的斜率。这些通常由于初始滞后和由于底物耗尽而后期减缓，呈现出轻微的S形。确定测试样本线性中间部分的斜率，并减去背景对照的斜率以校正非GPx贡献。将校正背景后的斜率除以标准曲线的斜率，得到每孔样本的斜率（纳摩尔/分钟，即毫单位）。要将结果换算回每单位样本的毫单位：

-A.将每孔的毫单位除以加入孔中的样本体积=每微升样本的毫单位。

-B.将每微升样本的毫单位乘以上述步骤2中离心后获得的上清液总体积=样本中总GPx的毫单位。

-C.将样本中的总GPx除以组织毫克数或细胞数量等=每毫克（或细胞数量等）的GPx活性毫单位。

仅用于研究！  

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辅酶Ⅱ(NADP)-还原型辅酶Ⅱ(NADPH)测定试剂盒-低至100皮摩尔水平定量检测

NADP和NADPH在代谢和氧化还原反应中发挥着关键作用。NADP作为多种酶促反应的辅酶，尤其在光合作用和抗氧化应激防御中起重要作用。NADPH是NADP的还原形式，对生物合成反应（如脂肪酸和核苷酸合成）至关重要。此外，NADPH作为一种强还原剂，保护细胞免受氧化损伤并维持氧化还原平衡。NADP和NADPH之间的动态相互作用对细胞功能和整体代谢平衡不可或缺。AkrivisBio的NADP/NADPH检测试剂盒是一种简单、灵敏的比色法检测方法，能够在多种生物样本中低至100皮摩尔水平定量检测NADP和/或NADPH。

艾美捷辅酶Ⅱ(NADP)-还原型辅酶Ⅱ(NADPH)测定试剂盒：

货号：MA-0126

规格：100孔

样本类型：细胞裂解液、组织裂解液

适用物种：所有

检测方法：比色法，吸光度450纳米

检测类型：定量检测

应用：一种基于微孔板的比色法检测方法，用于在多种生物样本中测量NADP和/或NADPH水平。

灵敏度：100皮摩尔

储存条件：-20°C

运输温度：冰凝胶包运输

保质期：自发货之日起一年

辅酶Ⅱ(NADP)-还原型辅酶Ⅱ(NADPH)测定试剂盒检测原理：

1.样本中存在的NADP被特异性的NADP依赖型乙醇脱氢酶转化为NADPH。

2.NADPH用于还原一种近乎无色的四氮唑盐，生成高度有色的甲臜。在此过程中，NADPH被重新转化为NADP。

3.通过在选定缓冲液中适当pH下孵育，可以选择性地破坏样本中的NADP，而不影响NADPH。

辅酶Ⅱ(NADP)-还原型辅酶Ⅱ(NADPH)测定试剂盒内容：

-提取缓冲液：50毫升（MA-0126A）

-循环缓冲液：15毫升（MA-0126B）

-乙醇脱氢酶：0.2毫升（绿色，MA-0126C）

-WST试剂：冻干粉（紫色，MA-0126D）

-终止液：1.2毫升（红色，MA-0126E）

-NADPH标准品：冻干粉（黄色，MA-0126F）

用户自备材料：

-PBS

-DMSO

-10kDa分子量截止离心过滤器

储存和处理：

-未开封的试剂盒应储存于-20°C。

-打开前将所有小瓶短暂离心数秒。

-使用前将试剂盒组分恢复至室温。

-提取缓冲液和循环缓冲液：即用型，储存于4°C。

-乙醇脱氢酶：使用时置于冰上。如果试剂盒将在几周内多次使用，可分装成小份量并储存于-20°C。

-WST试剂：用1.2毫升去离子水溶解。静置2分钟后轻轻振荡以溶解。储存于4°C。

-终止液：即用型，储存于4°C。

-NADPH标准品：用200微升DMSO溶解。储存于4°C。

检测步骤：

1.标准曲线：将NADPH标准品稀释至0.4微摩尔/升（将10微升标准品转移至含有990微升提取缓冲液的试管中，得到4皮摩尔/微升NADPH）。将稀释后的NADPH标准品0、5、10、15、20、25微升分别转移至96孔板的一系列孔中，双份进行，分别得到0、20、40、60、80和100皮摩尔/孔。用提取缓冲液将所有孔的体积调整至50微升。

注意：稀释后的NADPH溶液不稳定，必须在几小时内使用。细胞或组织裂解后的NADPH易因多种酶的存在而降解。通过以下方法可以更好地保存NADP/NADPH：将裂解样本通过10kDa分子量截止滤器过滤，或使用我们的样品脱蛋白试剂盒沉淀蛋白（确保最终溶液呈中性或碱性）。

2.样本准备：

-细胞：用冰冷的PBS洗涤细胞（4×10⁶个）或组织（50毫克）。以2000×g离心5分钟收集洗涤后的细胞。移除上清液，加入800微升提取缓冲液，混合后置于冰上10分钟。以16,000×g离心，将上清液转移至新的试管中。

-组织：用500微升提取缓冲液匀浆化，置于冰上10分钟。以16,000×g离心10分钟，将上清液转移至新的试管中。

-总NADP+NADPH检测：将50微升提取后的样本转移至96孔板的孔中，双份进行。

-仅检测NADPH：将200微升每个样本转移至微量离心管中，在60°C下加热30分钟以分解NADP。在此条件下，NADP被选择性分解。冷却至冰上。如有沉淀，短暂离心样本。将50微升每个样本转移至96孔板的孔中，双份进行。

3.启动反应：每个孔需要100微升反应混合液。根据要检测的孔数准备足够的反应混合液。

-循环缓冲液：98微升

-乙醇脱氢酶：2微升

混合均匀后，将100微升混合液加入每个孔中。让孔板静置5分钟，以将NADP转化为NADPH，然后再启动循环反应。

4.向每个孔中加入10微升WST试剂并混合。

5.测量：在室温下，以动力学模式在450纳米处监测反应，最长可达4小时。

注意：这是一个动力学检测，反应速率与NADPH的量成正比。如果需要，可以通过向每个孔中加入10微升终止液来停止反应。反应停止后，颜色在密封孔板中可稳定保持24-48小时。

6.典型结果：

7.计算：使用固定时间点的值或通过确定各个反应的斜率，从所有标准品和样本中减去0标准品的值。仔细检查动力学曲线，并选择仅包含吸光度随时间线性增加的时间范围。随着吸光度的增加，反应速率趋于下降，导致反应进程呈现向下曲线。将标准曲线绘制为吸光度或斜率与NADPH皮摩尔的关系。标准曲线的上端出现凸起，显示出轻微的非线性，不在直线上的点应被排除。将标准曲线的斜率应用于每个样本，即将样本值除以标准曲线的斜率。

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