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Flipper TR膜张力传感器光物理特性和作用机制分析

Flipper-TR是一种荧光探针，能够特异性靶向细胞的质膜，并通过其荧光寿命的变化报告膜张力的变化。它是Flipper探针家族中最先进的成员（参见文献2和3），通过机械感受基团中两个扭曲的二噻吩并噻吩之间的扭转角度和偏振的变化来感知脂质双层膜的组织变化。Flipper-TR能够自发地插入细胞的质膜中，并且只有在插入脂质膜时才会发出荧光。它具有宽吸收和发射光谱，通常可以用488 nm激光进行激发，而发射光则在575至625 nm之间收集。Flipper-TR适用于多种生物体，包括细菌、酵母、哺乳动物和植物。

艾美捷Flipper TR膜张力传感器（CY-SC020）光物理特性：

- 吸收波长（λabs）：480 nm

- 发射波长（λem）：600 nm

- 最大摩尔吸光系数（εmax）：1.66×10⁴ mol⁻¹·cm⁻¹（DMSO中）

- 荧光寿命：2.8 - 7 ns

- 量子产率（QY）：30%（乙酸乙酯中）

Flipper TR膜张力传感器的作用机制示意图：

图：左侧为Flipper-TR分子的示意图。中间为低张力脂质双层，其中Flipper呈扭曲状态；右侧为探针呈平面状态。

储存与操作：

收到后将探针储存于-20°C。使用新鲜且无水的DMSO配制探针溶液（因为陈旧和含水的DMSO会显著缩短探针的保质期）。使用后将探针溶液储存于-20°C。在打开前，应将小瓶恢复至室温。如果储存得当，溶液中的探针应可在3个月内保持稳定。注意：DMSO溶液应特别小心处理，因为DMSO已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关的当地规定处理这些试剂。

标记协议：

注意：本协议是使用贴壁于盖玻片的HeLa细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到验证。实验协议的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。

1. 配制1 mM储备液：将Flipper-TR小瓶的内容物溶解在50 µL无水DMSO中，制备1 mM储备液。该溶液应储存于-20°C或更低温度。不要将溶液分装成小份，因为它们会更快降解，且该化合物不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，该储备液应可在三个月内保持稳定。（可选）如果需要准确测定储备液的浓度，可将1 µL 1 mM储备液稀释在99 µL DMSO中。在425 nm处测量吸光度。使用上述给定的消光系数计算浓度。

2. 配制染色液：在应用于细胞之前，将Flipper-TR稀释至所需浓度（从1 µM开始）的细胞培养基中（不要在使用前保存染色液超过2小时）。注意：当使用含有胎牛血清（FCS）或其他血清的细胞培养基时，与不含血清的培养基相比，标记效率可能会降低。如果观察到信号较低，可以将探针浓度增加至2 µM。

3. 细胞准备和染色：按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润环境中孵育15分钟，然后进行成像。30分钟或更长时间后，由于膜的周转，可能会观察到内质网结构的标记。然而，其他含有膜的细胞器（内质网、高尔基体）的标记是有限的。内质网结构通常具有较短的寿命。可选地，可以移除含有探针的培养基，并用新鲜培养基洗涤细胞一次。由于探针仅在膜中具有荧光，因此不需要移除探针，特别是在计划进行长期成像（>24小时）且培养基中含有血清的情况下。在低于1 µM的探针浓度下，与探针孵育2-3天后未观察到对细胞活力的影响

4. FLIM成像：使用标准的FLIM显微镜对细胞进行成像，使用485 nm或488 nm脉冲激光进行激发，并通过600/50 nm带通滤光片收集光子。我们建议优化标记程序以及图像采集设置，以尽量减少488 nm激发光对活样本的光损伤。为了提取寿命信息，将感兴趣区域（ROI）或单像素（积累足够计数以确保良好统计）的光子直方图拟合为双指数，并提取两个衰减时间τ₁和τ₂。具有较高拟合振幅的最长寿命τ₁用于报告膜张力，其值在2.8至7.0 ns之间。寿命越长，膜的张力越大。τ₂的值较小（在0.5至2 ns之间），且拟合振幅较小，不太适合用于研究膜张力。可以使用参考文献1中给出的校准程序将寿命与绝对膜张力相关联。

重要注意事项：

- 只能通过FLIM显微镜进行膜张力测量，荧光强度或波长不能可靠地报告膜张力。

- 随时间变化脂质组成的系统也可能导致Flipper-TR寿命的变化。

- FLIM成像是一种高级显微镜技术，需要配备适当的激发激光器、光子计数系统和发射滤光片的商业或定制FLIM显微镜系统。建议客户咨询其仪器负责人或联系显微镜制造商，以确保其系统能够成像Flipper-TR的荧光和寿命。

文献参考：

1) Colom A, et al: A fluorescent membrane tension probe. Nat Chem, 2018, 10:1118–1125 ().

2) Dal Molin M, et al: Fluorescent flippers for mechanosensitive membrane probes. JACS, 2015, 137:568-571.

3) Soleimanpour S, et al: Headgroup engineering in mechanosensitive membrane probes. Chem Commun (Camb) 2016,52:14450-14453.

https://www.amyjet.com/products/CY-SC020.shtml

微管蛋白(纯度>99%):猪脑，高纯度、多用途

微管蛋白(纯度>99%):猪脑--微管蛋白是从猪脑中提取的，采用Shelanski等人的方法（1）进行纯化，并通过阳离子交换色谱进一步纯化至>99%纯度。微管蛋白以白色冻干粉的形式提供。

微管蛋白(纯度>99%):猪脑完全具有聚合活性，采用专利技术冻干，以提高稳定性和使用寿命。T240在4°C干燥条件下可稳定保存1年。

艾美捷微管蛋白(纯度>99%):猪脑（T240-A-T）生物活性：

1单位微管蛋白定义为5.0 mg纯化蛋白（通过Precision Red高级蛋白定量试剂货号ADV02测定）。T240的生物活性通过微管蛋白聚合检测进行评估。通过观察微管蛋白溶液在340 nm处的光密度增加，可以跟踪微管蛋白聚合为微管的能力。在37°C下，使用0.8 cm光程（1/2面积96孔板中180 µL样本体积）的分光光度计，5 mg/ml微管蛋白溶液在通用微管蛋白缓冲液中加入5%甘油和1 mM GTP，应在30分钟内达到0.75-1.10的OD340 nm读数。

需要注意的是，不含甘油的微管蛋白在G-PEM缓冲液中直到非常高浓度（>10 mg/ml）才会聚合，即使在这种浓度下，聚合速度也相对较慢。通过添加聚合促进化合物（例如甘油、紫杉醇或DMSO），可以在低浓度下实现不含甘油的微管蛋白的高效聚合。

纯度：纯度通过SDS-PAGE凝胶上蛋白质的扫描分光光度法测定。样品纯度>99%。

图1：20 µg的T240蛋白在10% SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，并用考马斯亮蓝染色。蛋白质定量使用Precision Red蛋白定量试剂（货号ADV02）进行。

微管蛋白(纯度>99%):猪脑用途包括：

1抗微管蛋白配体的IC50和EC50测定。

2微管结合研究。

3微管蛋白单体结合研究。

4组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）研究。

5微管激活的驱动蛋白ATP酶检测。

文献参考：

Shelanski, M. L., et al. (1973). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70, 765-768

罗丹明标记鬼笔环肽(14uM甲醇)应用方案

鬼笔环肽是一种来自毒鹅膏菌（Amanita phalloides）的七肽毒素，能够特异性且高亲和力（解离常数Kd为20 nM）地结合到聚合态肌动蛋白（F-肌动蛋白）上。鬼笔环肽可将肌动蛋白聚合的临界浓度降低至不到1 µg/ml，从而作为聚合增强剂发挥作用。鬼笔环肽已被四甲基罗丹明B异硫氰酸酯（1）标记，广泛用于替代肌动蛋白抗体，特异性地标记组织培养细胞和组织切片（2，见图1）以及无细胞体系中的肌动蛋白丝。罗丹明标记的鬼笔环肽肌动蛋白丝保留了许多未标记肌动蛋白的功能特性，包括其与肌球蛋白相互作用的能力。

艾美捷罗丹明标记鬼笔环肽(14uM甲醇)#PHDR1：

材料：罗丹明鬼笔环肽以粉红色固体形式提供，分子量为1306。1×工作液的PHDR1足以对300-350个盖玻片（22×22 mm）上的细胞进行染色（图1）。

注意：鬼笔环肽有毒，必须小心处理（人LD50 = 2 mg/Kg）。

储存与复溶：- 室温运输。短暂离心以将产品收集到试管底部。用500 µL 100%甲醇复溶，制备14 µM溶液。建议将溶液分装成10份×50 µL，置于-20°C避光保存，可稳定保存6个月。冻干产品在4°C干燥（<10%湿度）条件下可稳定保存1年。

免疫荧光应用方案：

用于组织培养细胞中肌动蛋白丝的荧光染色有多种方法。固定程序对于获得细胞内F-肌动蛋白分布的真实表现至关重要。应根据实验要求选择固定方法。用甲醛或戊二醛固定组织培养细胞，可获得良好的肌动蛋白丝染色效果和片状伪足的保存效果。

试剂：

1. 罗丹明鬼笔环肽（货号PHDR1）

2. 在玻璃盖玻片上生长至半融合状态的瑞士3T3细胞

3. 可以从Cytoskeleton, Inc.获取F-肌动蛋白染色试剂盒（货号BK005），或者自行准备以下4至7号试剂

4. 磷酸盐缓冲液（PBS，50 mM磷酸钾，pH 7.4，50 mM NaCl）

5. 固定液（PBS中的4%甲醛，需要将pH调至7.0）

6. 通透缓冲液（PBS中的0.5% Triton X-100）

7. 抗淬灭封固介质（Fluka BioChemika，货号10981）

8. PBS中的100 nM DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）

9. 玻璃载玻片（25×75×1 mm）

10. 封固盖玻片的溶液（透明指甲油）

图1：瑞士3T3细胞中的肌动蛋白应力纤维

图例：瑞士3T3细胞在玻璃盖玻片上生长至半融合状态，并按方法描述用罗丹明鬼笔环肽固定和染色。细胞在配备数字CCD相机和100×物镜的荧光显微镜下观察。注意细胞中广泛分布的肌动蛋白应力纤维（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）复染。

设备：

1. 荧光显微镜，配备罗丹明的激发滤光片（535±20 nm）和发射滤光片（585±20 nm），以及DAPI的激发滤光片（355±20 nm）和发射滤光片（460±20 nm）。

2. 数字CCD相机。

方法：

1. 在玻璃盖玻片上培养组织培养细胞，直至半融合。

2. 通过将3.5 µL 14 µM标记的罗丹明鬼笔环肽储备液稀释到500 µL PBS中，制备100 nM的工作液。在室温下避光保存。

3. 移去培养基，用37°C的PBS轻轻洗涤细胞一次。

4. 在室温下用固定液固定细胞10分钟。

5. 在室温下用PBS洗涤细胞一次，持续30秒。

6. 在室温下用通透缓冲液通透细胞5分钟。

7. 在室温下用PBS洗涤细胞一次，持续30秒。

8. 将盖玻片移至湿盒中的蜡纸上，加入200 µL 100 nM罗丹明鬼笔环肽。在室温下避光孵育30分钟。

9. 用PBS洗涤盖玻片三次。

10. 用200 µL 100 nM DAPI在PBS中复染DNA 30秒。

11. 用PBS冲洗盖玻片，并将其倒置在玻璃载玻片上的抗淬灭封固介质滴上。用纸巾轻轻擦去多余介质，并用指甲油密封四周。

12. 将载玻片置于4°C避光保存。

13. 典型的F-肌动蛋白染色结果见图1。

https://www.amyjet.com/products/PHDR1.shtml

SiR-微管蛋白试剂盒，高特异性低背景细胞成像

SiR-微管蛋白基于硅罗丹明（SiR）荧光团和微管结合药物多西他赛。SiR-微管蛋白能够以高特异性和低背景在活细胞中标记微管（1）。SiR-微管蛋白的关键特性包括：i）远红光吸收和发射波长；ii）细胞通透性；iii）荧光生成特性；iv）与超分辨率显微镜（STED和SIM）的兼容性。这些特性在一个探针中的独特组合使SiR-微管蛋白处于卓越的前沿。

艾美捷SiR-微管蛋白试剂盒（#CY-SC002）物理特性：

吸收波长（λabs）：652 nm

发射波长（λem）：674 nm

652 nm处的摩尔吸光系数（ε）：1.0×10⁵ mol⁻¹·cm⁻¹

分子量（MW）：1303.6 g/mol

分子式（MF）：C₇₃H₈₆N₄O₁₆S

储存与操作：

收到后将化合物储存于-20°C以下。使用无水DMSO配制化合物溶液。使用后将化合物溶液储存于-20°C以下。在打开前，应将小瓶恢复至室温。如果储存得当，化合物应可在数月内保持稳定。注意：DMSO溶液应特别小心处理，因为DMSO已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关的当地规定处理这些试剂。

标记协议：

注意：本协议是使用贴壁于盖玻片的人类成纤维细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到验证。实验协议的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。SiR-微管蛋白基于微管稳定药物多西他赛，因此可以改变活细胞中微管的动态。尽管间期细胞受探针影响较小，但在培养的HeLa细胞中，超过100 nM的SiR-微管蛋白浓度会导致有丝分裂期延长（1）。如果计划进行长期成像实验且微管动态至关重要，建议将SiR-微管蛋白的浓度保持在100 nM或以下。对于其他用途，建议使用1 µM的SiR-微管蛋白进行染色。

1. 配制1 mM储备液：将SiR-微管蛋白小瓶的内容物溶解在50 µL无水DMSO中，制备1 mM储备液。该溶液应储存于-20°C或更低温度。不要将溶液分装成小份，因为它们会更快降解，且该化合物不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，该储备液应可在三个月或更长时间内保持稳定。如果需要准确测定储备液的浓度，可将1 µL 1 mM储备液稀释在99 µL含有0.2% SDS的PBS中。在室温下静置15分钟后，在652 nm处测量吸光度。使用上述给定的消光系数计算浓度。

2. 配制染色液：在细胞培养基（例如DMEM + 10%胎牛血清）中将SiR-微管蛋白稀释至所需浓度，并短暂涡旋。由于染色效率可能因细胞系而异，建议首次尝试时使用1 µM浓度以快速获得强染色效果，然后在后续实验中降低SiR-微管蛋白浓度，直至获得最佳染色效果（参见下表中的标记浓度和孵育时间）。某些细胞系可能表达高水平的外排泵，因此SiR-微管蛋白染色效果较差。在染色液中加入10 µM维拉帕米（一种广谱外排泵抑制剂）通常可以显著改善染色效果。

3. 细胞准备和染色：按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润环境中孵育，并根据标记时间作为探针浓度的函数。

*标记时间是针对人类成纤维细胞确定的，可能会因使用的细胞系而有所不同。

重要提示：SiR-微管蛋白不能染色用甲醛（PFA）和甲醇固定的细胞，因为这些固定方法会改变微管上探针的结合位点。

细胞成像：使用标准Cy5设置对SiR-微管蛋白进行成像效果最佳。标记后，活细胞可以立即成像，无需洗涤步骤。可选地，用不含探针的新鲜培养基替换一次标记液通常可以提高信噪比。如果进行时间序列成像，建议在整个实验过程中将探针浓度保持在100 nM或以下，以获得稳定的信号并避免探针干扰微管动态（延长有丝分裂期和降低细胞增殖）。如果在成像前对细胞进行了洗涤，染色效果将持续数小时。

文献参考：

1. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton, G. Lukinavičius et al., Nature Methods, 11, 731–733 (2014)

https://www.amyjet.com/products/CY-SC002.shtml

G-Actin:F-Actin体内测定试剂盒，助力药物对G-肌动蛋白与F-肌动蛋白研究

确定细胞群体中丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）含量与游离球状肌动蛋白（G-肌动蛋白）含量比例最可靠且准确的方法是通过西方印迹法定量分析F-肌动蛋白和G-肌动蛋白的细胞分离组分（1-4）。通常的方法是将细胞在F-肌动蛋白稳定缓冲液中匀浆，随后通过离心分离F-肌动蛋白与G-肌动蛋白库。然后通过SDS-PAGE分离各组分，并通过西方印迹法定量分析肌动蛋白。最终结果提供了确定细胞骨架中整合的F-肌动蛋白与细胞质中G-肌动蛋白比例的最准确方法。本试剂盒包含了进行该检测所需的所有试剂。

G-Actin:F-Actin体内测定试剂盒（#BK037）内容：

试剂盒包含的材料足够进行30-100次检测，具体取决于检测设置，并包括用于阳性和阴性对照的试剂。包含以下组分：

裂解液和F-肌动蛋白稳定缓冲液

ATP（货号BSA04）

蛋白酶抑制剂混合物（货号PIC02）

F-肌动蛋白增强对照溶液

F-肌动蛋白解聚对照溶液

对照G-肌动蛋白标准品（货号AKL99）

抗肌动蛋白单克隆抗体（克隆7A8.2.1）（货号AAN02-S）

SDS样品缓冲液（5倍浓缩）

DMSO

详细的操作手册和广泛的故障排除指南

G-Actin:F-Actin体内测定试剂盒用途包括：

研究药物对G-肌动蛋白与F-肌动蛋白比例的影响。

研究突变细胞系与其亲本细胞系在G-肌动蛋白与F-肌动蛋白比例变化方面的差异。

研究环境物理变化对G-肌动蛋白与F-肌动蛋白比例的影响。

所需设备：

能够达到100,000×g的温控离心机。理想情况下可接受100 µL样本体积。虽然该检测可以适应更大体积，但这可能会导致每盒试剂的检测次数减少（见第六部分：检测协议）。

适合低毫升体积的小型匀浆器或25G针头和注射器。

SDS-PAGE和西方印迹装置及试剂，抗小鼠-HRP二抗

示例结果：

瑞士3T3细胞在DMEM/10% FBS中培养至50%融合度，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%。细胞未处理（泳道1P和1S），或用0.1 µM的肌动蛋白聚合药物jasplakinolide处理30分钟，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%（泳道2P和2S）。细胞裂解后，处理成上清液（S）和沉淀（P）组分，并根据G-肌动蛋白/F-肌动蛋白体内检测试剂盒说明书通过西方印迹法定量分析肌动蛋白。

图1：在未处理的瑞士3T3细胞中，45%的肌动蛋白为可溶性G-肌动蛋白（1S），55%为不溶性F-肌动蛋白（1P）。这与已发表的数据一致（3）。图2：在用肌动蛋白聚合药物jasplakinolide处理的瑞士3T3细胞中，仅有5%的肌动蛋白保留在可溶性G-肌动蛋白组分（2S）中，而95%存在于不溶性F-肌动蛋白沉淀组分（2P）中。泳道50、20和10分别代表50 ng、20 ng和10 ng的G-肌动蛋白标准品。M代表分子量标记（标记的分子量显示在印迹右侧）。

G-Actin:F-Actin体内测定试剂盒文献参考：

Milligan R.A. et al. 1990. Molecular structure of F-actin and location of surface binding sites. Nature 348, 217-221.

Dos Remedios C.G. et al. 2003. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiol. Rev. 83, 433-473.

Phillips D.R. et al. 1980. Identification of membrane proteins mediating the interaction of human platelets. J. Cell Biol. 86, 77-86.

Kim H.R. et al. 2008. Cytoskeletal remodeling in differentiated vascular smooth muscle is actin isoform dependent and stimulus dependent. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, C768-C778.

SPY555-DNA探针--明亮且无毒的活细胞核染料

SPY555-DNA是一种基于我们SPY™染料系列的明亮且无毒的活细胞核染料。其优化的结构能够快速标记活细胞和固定细胞中的DNA，具有高特异性和极低的背景信号。SPY555-DNA可以在不需要遗传操作或荧光蛋白过表达的情况下，对活细胞或固定细胞的细胞核进行染色。其吸收和发射特性与四甲基罗丹明（TMR）相似。SPY555-DNA能够与SPY505、SPY595、SPY650、SPY700、SiR和GFP进行多色成像。SPY555-DNA可以使用标准的TMR或Cy3滤光片组进行成像。它适用于活细胞或固定细胞和组织的宽场、共聚焦、SIM或STED成像。包含1瓶SPY555-DNA（冻干）。

艾美捷SPY555-DNA探针（#CY-SC201）：

吸收峰（λabs）：555 nm

荧光峰（λfl）：580 nm

是否适用于固定细胞：是，适用于PFA和甲醇固定的细胞

探针数量：100次染色

荧光寿命：2.4 ns

STED耗竭波长：660或775 nm

运输条件：室温

储存与操作：

收到后将探针储存于-20°C或更低温度。冻干探针在室温下可稳定保存超过1周，在-20°C下可稳定保存超过12个月。使用无水DMSO复溶SPY555-DNA。我们建议使用新开封的无水DMSO来制备1000倍浓缩液。DMSO在接触空气和水分时会产生降解产物，这些产物即使在-20°C下也会显著缩短溶液中探针的保质期。使用后，将1000倍浓缩液保存在-20°C或更低温度。在打开前，应将小瓶恢复至室温。如果储存得当，1000倍浓缩液可稳定保存3个月。注意：DMSO溶液应特别小心处理，因为DMSO已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关的当地规定处理这些试剂。

标记协议：

注意：本协议是使用贴壁于盖玻片的HeLa细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到验证。本协议中的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。SPY555-DNA基于DNA小沟结合分子双苯并咪唑。在高剂量下，它可能会改变活细胞中的DNA代谢。因此，如果计划进行长期（>12小时）成像实验，建议使用1000倍或更高稀释度的SPY555-DNA进行染色。对于其他所有用途，建议使用1000倍稀释度的SPY555-DNA进行染色。

制备1000倍浓缩液：向SPY555-DNA小瓶中加入50 µL无水DMSO，制备1000倍浓缩液。我们建议使用新开封的无水DMSO来制备1000倍浓缩液。DMSO在接触空气和水分时会产生降解产物，这些产物即使在-20°C下也会显著缩短溶液中探针的保质期。此时，溶液可能有颜色，但这不会影响探针的性能。使用后，应将该溶液保存在-20°C或更低温度。不要将1000倍浓缩液分装成小份，因为它们会更快降解，且探针不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，该浓缩液可稳定保存3个月。

制备染色液：在常用的细胞培养基（例如DMEM + 10%胎牛血清）中将SPY555-DNA稀释至1倍浓度，并短暂涡旋。如果稀释不是一步完成，请使用DMSO制备中间稀释液，因为使用水性缓冲液制备中间稀释液会导致探针聚集。快速进行下一步。由于染色效率可能因细胞系而异，建议首次尝试时使用1000倍稀释度进行染色，然后在后续实验中优化SPY555-DNA的稀释倍数，直至获得最佳染色效果（参见下表中的标记浓度和孵育时间）。仅使用新制备的染色液，不要多次使用。

细胞准备和染色：按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用步骤2新制备的染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润环境中孵育，并根据确定标记时间作为探针浓度的函数。

注意：SPY555-DNA可以染色用甲醛（PFA）和甲醇固定的细胞中的DNA。

细胞成像：使用标准TMR或Cy3设置对SPY555-DNA进行成像效果最佳。标记后，活细胞可以立即成像，无需洗涤步骤。可选地，用不含探针的新鲜培养基替换一次标记液通常可以提高信噪比。如果进行时间序列成像，建议在整个实验过程中保持成像介质中含有探针，以获得稳定的信号。如果在成像前对细胞进行了洗涤，染色效果将持续数小时。请注意，SPY555-DNA可能会被360-390 nm的光激发，并由于探针的DNA结合部分的荧光而在约450 nm处产生一些荧光。

*基于以下条件：每次染色实验使用0.5 ml染色溶液，探针浓度为1倍。通过减少体积或探针浓度，可以进一步增加染色实验的次数。

**标记时间是针对HeLa细胞确定的，可能会因使用的细胞系而有所不同。

https://www.amyjet.com/products/CY-SC201.shtml

Tubulin聚合检测(荧光法96assays 猪脑微管蛋白)试剂盒-研究更昂贵的癌细胞微管蛋白试剂和高通量应用选择

本检测是一种经济高效的一步法程序，用于测定药物或蛋白质对微管蛋白聚合的影响。它是基于Bonne, D.等人（1）最初描述的检测方法的改进版。聚合过程通过荧光增强来跟踪，因为荧光报告分子在聚合过程中被整合到微管中。标准检测使用神经元微管蛋白（货号T240），生成代表微管形成三个阶段的聚合曲线，即成核、生长和稳态平衡。其他微管蛋白，如HeLa细胞微管蛋白（货号H001），也可以用于此检测。每次检测的体积为50 µL，微管蛋白浓度低（最终浓度为2 mg/ml，每次检测100 µg），这使得它成为研究更昂贵的癌细胞微管蛋白试剂和高通量应用的理想选择。

经典的微管蛋白聚合检测使用340 nm处的吸光度读数来跟踪微管的形成。它基于这样一个事实：微管散射光的程度与微管聚合物的浓度成正比。Cytoskeleton, Inc.提供这种基于吸光度的检测（货号BK006P）。

艾美捷Tubulin聚合检测(荧光法96assays 猪脑微管蛋白)试剂盒（#BK011P）内容：

试剂盒包含足够进行96次50 µL格式检测的材料。包含以下组分：

>99%纯度的微管蛋白（货号T240）

含荧光报告分子的通用微管蛋白缓冲液

微管甘油缓冲液（货号BST05）

GTP溶液（货号BST06）

紫杉醇阳性对照（货号TXD01）

半面积96孔板。黑色，平底

详细的操作手册和广泛的故障排除指南

Tubulin聚合检测(荧光法96assays 猪脑微管蛋白)试剂盒用途包括：

1成本效益高的抗癌化合物高通量筛选。

2基础研究，用于测定化合物对微管蛋白的IC50值和特异性。

3筛选对微管蛋白聚合活性有影响的蛋白质。

4作为药理学本科/研究生课程的教学辅助工具。

所需设备：配备340-360 nm激发滤光片和420-450 nm发射滤光片的温控96孔板荧光光度计

示例结果：

与微管蛋白相互作用的化合物或蛋白质通常会改变聚合的一个或多个特征阶段。例如，图1显示了向标准聚合反应中加入抗有丝分裂药物紫杉醇的效果。3 µM浓度的紫杉醇消除了成核阶段，并增强了生长阶段的最大反应速率（Vmax）。因此，本检测的一个应用是鉴定新型抗有丝分裂药物。图1还显示了加入微管解聚药物长春碱的效果。在3 µM的最终浓度下，长春碱导致Vmax大幅下降和最终聚合物质量减少。

图1：使用基于荧光的微管蛋白聚合检测（BK011P）进行的微管蛋白聚合。微管蛋白单独孵育（对照组），或与紫杉醇或长春碱共同孵育。每种条件均进行双份检测。通过在360 nm处激发和在420 nm处发射来测量聚合。对照组聚合曲线的三个阶段已标记：I. 成核；II. 生长；III. 稳态平衡。

文献参考：

Bonne, D., Heusele, C., Simon, C., and Pantaloni, D.  (1985).  4’, 6-Diamidino-2-phenylindole, a fluorescent probe for tubulin and mictrotubules. J. Biol. Chem. 260, 2819-2825.

https://www.amyjet.com/products/BK011P.shtml

原肌球蛋白/原肌球调节蛋白复合物,牛心脏生物活性检测分析

从牛心肌中纯化的肌钙蛋白/原肌球蛋白复合物（TT复合物）（1）。TT复合物由五种蛋白质组成：原肌球蛋白α、原肌球蛋白β、肌钙蛋白C、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T，其化学计量比为1:1:1:1:1（见图1）。该复合物已在F-肌动蛋白/钙激活肌球蛋白ATP酶检测中被确定具有生物活性（见生物活性检测）。该复合物以白色冻干粉的形式提供。

纯度：

通过扫描分光光度法测定考马斯亮蓝染色的蛋白质在4-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶上的纯度。TT复合物的纯度被确定为85%（见图2a）。使用针对每个组分的抗体来验证每个组分的存在（见图2b）。

图2a：20 µg的TT复合物蛋白在4-20% SDS-PAGE系统中通过电泳分离，并用考马斯亮蓝染色。箭头1表示肌钙蛋白T（38 kDa），箭头2表示原肌球蛋白（α+β，32 kDa），箭头3表示肌钙蛋白I（24 kDa），箭头4表示肌钙蛋白C（18 kDa）。

图2b：2 µg的TT复合物蛋白在4-20% SDS-PAGE系统中通过电泳分离，转印到PVDF膜上，并用特异性单克隆抗体进行探针检测。泳道3：原肌球蛋白（α+β，32 kDa，单克隆抗体克隆：TM311），泳道4：肌钙蛋白T（38 kDa，单克隆抗体克隆JLT-12来自Sigma）（抗体给出24 kDa信号——与肌钙蛋白I交叉反应？），泳道5：肌钙蛋白I（24 kDa，单克隆抗体克隆MAB1691），泳道6：肌钙蛋白C（18 kDa，单克隆抗体克隆7B9）。

艾美捷原肌球蛋白/原肌球调节蛋白复合物,牛心脏（#CS-TT05）用途：

1测量与细丝结合时的钙激活肌球蛋白ATP酶活性。

2识别/表征影响TT复合体调控和肌球蛋白ATP酶活性的蛋白质或小分子。

3识别/表征影响肌球蛋白/F-肌动蛋白相互作用的蛋白质或小分子。

储存与复溶：

短暂离心以将产品收集到试管底部。通过加入冰冻的Milli-Q水将蛋白质复溶至3 mg/ml。蛋白质将处于以下缓冲液中：20 mM PIPES，pH 7.0，25 mM KCl，5%（w/v）蔗糖和1%（w/v）葡聚糖。为了保持蛋白质的高生物活性，建议将蛋白质溶液分装成“实验用量”，在液氮中快速冷冻并储存于-70°C。如果储存于-70°C，蛋白质可稳定保存6个月。蛋白质不应暴露于反复的冻融循环中。冻干的蛋白质在4°C干燥（<10%湿度）条件下可稳定保存1年。

生物活性检测：

TT复合物的生物活性可以通过其调节F-肌动蛋白激活肌球蛋白ATP酶的能力来确定。检测方法是首先使肌动蛋白聚合形成F-肌动蛋白，然后将TT复合物与肌动蛋白丝以化学计量比混合。这会形成类似于肌肉纤维细丝的包被丝。这些丝在100,000×g下离心，沉淀物在反应缓冲液中重新悬浮，从而纯化钙敏感复合物。肌球蛋白以亚化学计量比加入，并用ATP和钙启动反应。严格的质量控制确保在没有钙的情况下，TT复合物完全抑制肌球蛋白ATP酶。加入10 µM钙后，肌球蛋白ATP酶将被恢复。钙与肌钙蛋白C结合，使其从F-肌动蛋白上解离，从而允许肌球蛋白结合。

试剂

1. 心脏TT复合物（1×1 mg，货号TT05）

2. 心脏肌球蛋白S1（0.25 mg），货号MYS03

3. 心脏肌动蛋白（1 mg，货号AD99-A）

4. ATP酶生化试剂盒（货号BK051）

5. 50 mM Tris-HCl，pH 7.5中的100 mM ATP（100 µl）

6. 水中的1 M二硫苏糖醇（100 µl）

7. PM12反应缓冲液（12 mM Pipes-KOH，pH 7.0，2 mM MgCl₂）

8. 500 mM EGTA-Na，pH 8.0

设备：

1. 能够在360 nm（±5 nm带宽）处测量吸光度的分光光度计。推荐使用Spectra-Max M2（Molecular Devices），基于滤光片的机器不适合。

2. 半面积96孔微量滴定板（Corning货号3696或3697）

3. 多通道移液器

方法：

以下为主要步骤：

步骤1：准备所需的试剂和化合物。（30分钟）

步骤2：制备F-肌动蛋白聚合物储备液。（1小时）

步骤3：制备细丝储备液。（1.5小时）

步骤4：准备马达混合物和酶标仪。（15分钟）

步骤5：将马达混合物加入孔中并启动反应/酶标仪。（10分钟）

F-肌动蛋白聚合物储备液：

1. 用2.5 ml缓冲液将AD99复溶至0.4 mg/ml（测量蛋白浓度以获得更好的可重复性），缓冲液成分：5 mM Pipes-KOH，pH 7.0，500 µM ATP，500 µM DTT。

2. 在室温下放置10分钟以溶解肌动蛋白。

3. 然后加入2.0 mM MgCl₂和2.0 mM EGTA，在室温下孵育20分钟以聚合。（室温下保质期1小时）

原肌球蛋白/原肌球调节蛋白复合物,牛心脏文献参考：

1. J.M Murray. 1982. Hybridization and reconstitution of the thin filament. Methods in Enzymology, 85, p.15-17.

2. M.J. Holroyde et al. 1980. The calcium and magnesium binding sites on cardiac troponin their role in the regulation of myofibrillar adenosine triphosphatase.

https://www.amyjet.com/products/CS-TT05.shtml