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Cas9(CRISPR相关蛋白9)ELISA检测试剂盒的检测原理和步骤方案

Cas9（CRISPR相关蛋白9）是一种由RNA引导的DNA内切酶。这种酶与CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）适应性免疫系统相关，存在于多种细菌中，包括化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）。Cas9能够解开外来DNA（如质粒DNA或入侵噬菌体DNA），然后检查是否存在与引导RNA的20个碱基间隔区互补的位点。如果DNA底物与引导RNA互补，Cas9会切割入侵的DNA。

Cas9蛋白因其作为基因组工程工具而引起全球关注，它能够在DNA中引起定点的双链断裂。由此产生的DNA断裂可以通过非同源末端连接和同源重组分别失活基因或引入异源基因，这在许多实验室模型生物中得到了应用。此外，Cas9几乎可以切割与其相关引导RNA互补的任何序列。在人类细胞中，已通过CRISPR/Cas9系统实现了基因敲除和基因替换。

图1：CRISPR/Cas9 DNA编辑

艾美捷Cas9(CRISPR相关蛋白9)ELISA检测试剂盒是一种酶免疫测定法，用于检测和定量细胞或组织裂解液样本中的化脓性链球菌Cas9。该试剂盒的检测灵敏度下限为1.5 ng/mL Cas9。每套试剂盒提供足够的试剂，可进行多达96次检测，包括标准曲线和未知样本。

Cas9(CRISPR相关蛋白9)ELISA检测试剂盒相关产品：

1. AKR-120：GFP定量试剂盒，荧光法  

2. AKR-121：GFP ELISA试剂盒  

3. AKR-122：RFP ELISA试剂盒  

4. AKR-130：His标签蛋白ELISA试剂盒  

Cas9(CRISPR相关蛋白9)ELISA检测试剂盒（#PRB-5079）组成：

盒子1（室温运输）：

1. 抗Cas9抗体包被板（部件编号50791B）：一个96孔条板（8×12）。  

2. 生物素标记抗Cas9抗体（1000倍稀释）（部件编号50792C）：一个10 µL小瓶。  

3. 链霉亲和素-酶偶联物（部件编号310803）：一个20 µL小瓶。  

4. 检测稀释液（部件编号310804）：一个50 mL瓶。  

5. 10倍洗液（部件编号310806）：一个100 mL瓶。  

6. 底物溶液（部件编号310807）：一个12 mL棕色瓶。  

7. 终止液（部件编号310808）：一个12 mL瓶。  

盒子2（蓝色冰袋运输）：

1. Cas9标准品（部件编号50793D）：一个50 µL小瓶，含5 µg/mL重组化脓性链球菌Cas9。  

未提供材料：

1. 细胞或组织裂解液  

2. 含0.1% BSA的PBS  

3. RIPA缓冲液  

储存：

收货后，将Cas9标准品分装并储存于-80°C，以避免多次冻融循环。将生物素标记抗Cas9抗体储存于-20°C。将其他所有组分储存于4°C。  

样本准备：

以下建议仅供参考，可根据用户的实验设计进行优化或调整。  

- 细胞或组织裂解液：在裂解缓冲液（如RIPA缓冲液，25 mM Tris-HCl，pH 7.6，150 mM NaCl，1% NP-40，1%牛磺胆酸钠，0.1% SDS）中超声处理或匀浆样本，然后在4°C下以10,000 x g离心10分钟。立即进行检测，或在-80°C下储存样本，最长可达三个月。根据需要，将样本稀释于含0.1% BSA的PBS中。

检测步骤：

1. 向抗Cas9抗体包被板中加入100 µL Cas9未知样本或标准品。每个Cas9未知样本、标准品和空白对照均需进行双份检测。  

2. 在室温下于轨道振荡器上孵育1小时。  

3. 每孔加入250 µL 1倍洗液，洗涤微孔条3次，每次洗涤后彻底吸干。最后一次洗涤后，倒空孔内液体，并将微孔条在吸水垫或纸巾上轻拍以去除多余的1倍洗液。  

4. 向每孔中加入100 µL稀释后的生物素标记抗Cas9抗体。在室温下于轨道振荡器上孵育1小时。  

5. 按步骤3洗涤条孔3次。  

6. 向每孔中加入100 µL稀释后的链霉亲和素-酶偶联物。在室温下于轨道振荡器上孵育1小时。  

7. 按步骤3洗涤条孔3次，然后立即进行下一步。  

8. 将底物溶液平衡至室温。向每孔（包括空白孔）中加入100 µL底物溶液，在室温下于轨道振荡器上孵育。实际孵育时间可能在2-30分钟之间。  

注意：仔细观察平板；如果颜色迅速变化，可能需要提前终止反应，以防止饱和。  

9. 向每孔（包括空白孔）中加入100 µL终止液，终止酶反应。结果应立即读取（颜色会随时间消退）。  

10. 使用450 nm作为主波长，在分光光度计上读取每个微孔的吸光度。

Cas9(CRISPR相关蛋白9)ELISA检测试剂盒文献参考：

1. Heler, R; Samai, P; Modell, J. W.; Weiner, C; Goldberg, G. W.; Bikard, D; Marraffini, L. A.(2015). Nature. 519 :199–202.

2. Jinek, M.; Chylinski, K.; Fonfara, I.; Hauer, M.; Doudna, J. A.; Charpentier, E. (2012). Science.337: 816–821.

3. Mali, Prashant; Esvelt, Kevin M; Church, George M (2013). Nature Meth. 10: 957-963.

4. Mali, Prashant; Aach, John; Stranges, P Benjamin; Esvelt, Kevin M; Moosburner, Mark; Kosuri,Sriram; Yang, Luhan; Church, George M (2013). Nature Biotech. 31: 833-838.

5. Gilbert, Luke A.; Larson, Matthew H.; Morsut, Leonardo; Liu, Zairan; Brar, Gloria A.; Torres,Sandra E.; Stern-Ginossar, Noam;Brandman, Onn; Whitehead, Evan H.; Doudna, Jennifer A.;Lim, Wendell A.; Weissman, Jonathan S.; Qi, Lei S. (2013). Cell. 154: 442-451.

6. Zheng Q, Cai X, Tan MH, Schaffert S, Arnold CP, Gong X, Chen C-Z, and Huang S. (2014)BioTechniques 57:115-124.

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ViraBind腺病毒微量纯化试剂盒-快速纯化腺病毒，回收率超过95%

重组腺病毒在研究和治疗应用中具有巨大的潜力。  

使用腺病毒将遗传物质引入宿主细胞具有诸多优势。其允许的宿主细胞范围非常广泛。该病毒已被用于感染许多哺乳动物细胞类型（包括增殖性和非增殖性细胞），以实现重组蛋白的高效表达。重组腺病毒尤其适用于那些通过脂质体转染效率较低的细胞系中的基因转移和蛋白表达。病毒进入细胞后，保持染色体外状态（即不整合到宿主染色体中，因此不会激活或失活宿主基因）。最近，重组腺病毒已被用于将RNAi导入细胞。  

HEK 293细胞或其变体被用作病毒扩增的宿主细胞。重组腺病毒可以在高滴度下生长（10¹⁰病毒颗粒/mL，可浓缩至10¹³病毒颗粒/mL）。浓缩后的病毒上清液通过CsCl超速离心，将病毒与细胞蛋白和培养基成分分离。超速离心后，通过透析去除CsCl。CsCl程序既繁琐又耗时（16-24小时）。  

艾美捷ViraBind腺病毒微量纯化试剂盒不涉及超速离心，而是基于腺病毒衣壳蛋白的独特性质，通过离心柱捕获病毒。整个过程大约需要30分钟。每个离心柱设计用于从一个T75培养瓶或10厘米培养皿中收获的病毒进行纯化，容量可达1.0×10¹¹病毒颗粒。  

ViraBind 腺病毒小量纯化试剂盒提供了一个高效的系统，用于快速纯化腺病毒，回收率超过95%。

ViraBind腺病毒微量纯化试剂盒相关产品：  

1. AD-100：293AD细胞系  

2. AD-200：ViraDuctin 腺病毒转导试剂，10次转导  

3. VPK-109：QuickTiter 腺病毒滴度免疫测定试剂盒  

4. VPK-111：快速RCA测定试剂盒  

5. VPK-252：RAPAd® CMV腺病毒表达系统    

ViraBind腺病毒微量纯化试剂盒（#VPK-099）组成：  

1. ViraBind 离心柱和收集管（部件编号40991）：10个迷你离心柱和20个收集管的包装。  

2. 上样缓冲液（部件编号40992）：一瓶10 mL。  

3. 洗涤缓冲液（部件编号40993）：一瓶20 mL。  

4. 洗脱缓冲液（部件编号40994）：一瓶10 mL，含25 mM Tris，pH 7.5，2.5 mM MgCl₂，1 M NaCl。    

未提供材料：  

1. 感兴趣的重组腺病毒  

2. HEK 293细胞及细胞培养生长培养基  

3. 细胞培养离心机  

4. 甘油  

5. 微量离心机  

储存：将所有试剂盒组分储存于室温。

安全注意事项：请记住，您将处理含有感染性病毒的样本。请遵循NIH推荐的针对BSL-2生物体的所有材料的指南。

感染细胞裂解液的收获：  

以下程序适用于T75培养瓶，可根据个人需求进行优化。  

1. 使用HEK 293细胞，这些细胞应在感染前定期传代2-3次。将这些细胞培养至单层细胞达到90-100%汇合。  

2. 用新的生长培养基替换细胞培养基，每瓶15 mL。然后将腺病毒加入培养物中。可以使用粗制或纯化的病毒库存。每细胞期望的感染复数（PFU，噬菌斑形成单位）为0.5到2。  

3. 24小时后，部分细胞应处于悬浮状态。向培养瓶中加入10 mL生长培养基，并让病毒再扩增24小时。当所有细胞都处于悬浮状态时，轻轻摇晃培养瓶数次，并将所有培养基（包括细胞）收获到无菌管中。  

4. 以1000 rpm离心5分钟，沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于0.8 mL培养基中，并通过三次冻融循环从细胞中释放腺病毒。将上清液转移到另一个微量离心管中，并丢弃细胞碎片。  

5. 以10,000 rpm离心10分钟，进一步沉淀任何剩余的细胞碎片。丢弃沉淀，保存上清液。如果仍可见大量细胞碎片，再次离心上清液。  

注意：此步骤有助于防止在病毒纯化步骤中离心柱堵塞。  

6. 病毒上清液可在-80°C下保存，或立即进行纯化（见以下纯化说明）。   

结果示例：  

以下图表展示了典型的纯化结果。以下数据仅供参考，不应用于解释实际结果。

图上：重组Ad-β Gal的纯化。根据纯化说明纯化重组Ad-β Gal病毒。在纯化过程中获得的每个组分及其稀释液用于感染12孔板中的A549细胞。48小时后，进行X-gal染色，并对β Gal阳性细胞（蓝色）进行计分。

图下：由激活的H-Ras诱导的膜褶皱。COS-7细胞以50 MOI（感染复数）的感染量被纯化的Ad-β Gal或Ras G12V感染。感染48小时后进行X-gal染色。通过用罗丹明偶联的鬼笔环肽染色肌动蛋白细胞骨架，可视化膜褶皱。

ViraBind腺病毒微量纯化试剂盒文献参考：

1. Stewart, P. L., Fuller, S. D., and Burnett, R. M. (1993) EMBO J. 12, 2589-2599.

2. Robbins, P. D., Tahara, H., and Ghivizzani, S. C. (1998) Trends Biotechnol. 16, 35-40.

3. Huang, S., Stupack, D., Mathias, P., Wang, Y., and Nemerow, G. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.

U. S. A. 94, 8156-8161.

4. Bergelson, J. M., J. A. Cunningham, G. Droguett, E. A. Kurt-Jones, A. Krithivas, J. S. Hong, M. S.

Horwitz, R. L. Crowell, and R. W. Finberg. (1997) Science 275:1320-1323.

5. Von Seggern, D. J., C. Y. Chiu, S. K. Fleck, P. L. Stewart, and G. R. Nemerow. (1999) J. Virol.

73:1601-1608.

6. Kleinerman, D. I., W. W. Zhang, S. H. Lin, N. T. Van, A. C. von Eschenbach, and J. T. Hsieh.

(1995) Cancer Res. 55:2831-2836.

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CytoSelect 96孔细胞侵袭检测试剂盒，无需预先用Calcein AM标记细胞或移除未侵入的细胞

恶性肿瘤细胞侵入正常周围组织的能力在很大程度上导致了癌症的高发病率和死亡率。侵入性需要几种不同的细胞功能，包括黏附、运动、脱落和细胞外基质蛋白水解。转移性细胞产生许多蛋白水解酶（例如溶酶体水解酶、胶原酶、纤溶酶原激活剂），同时某些细胞表面蛋白酶受体的表达也增加。

Cell Biolabs的CytoSelect 96孔细胞侵袭检测试剂盒利用涂有基底膜的插入物来检测肿瘤细胞的侵袭特性。该试剂盒无需您预先用Calcein AM标记细胞或移除未侵入的细胞（即棉签擦拭）。任何侵入的细胞首先从膜上分离，然后裂解并用CyQuant® GR染料检测。

Cell Biolabs的CytoSelect 96孔细胞侵袭检测试剂盒提供了一个稳健的系统，用于定量测定细胞侵袭。试剂盒包含足够的试剂用于评估96个样本。

艾美捷CytoSelect 96孔细胞侵袭检测试剂盒（#CBA-112）检测原理： 

CytoSelect 96孔细胞侵袭检测试剂盒包含一个96孔板中的聚碳酸酯膜插入物（孔径8微米）。插入物膜的上表面涂有一层均匀的干燥基底膜基质溶液。这层基底膜作为屏障，区分侵袭性细胞和非侵袭性细胞。侵袭性细胞能够降解该层中的基质蛋白，并最终通过聚碳酸酯膜的孔。最后，侵入的细胞从膜上分离，并随后用CyQuant® GR染料（Invitrogen）检测。

相关产品：

1.CBA-101-C：CytoSelect24孔细胞迁移和侵袭检测（8微米，荧光法）

2.CBA-106-C：CytoSelect96孔细胞迁移和侵袭检测（8微米，荧光法）

3.CBA-111：CytoSelect24孔细胞侵袭检测（基底膜，荧光法）

4.CBA-111-COL：CytoSelect24孔细胞侵袭检测（I型胶原，荧光法）

5.CBA-112-COL：CytoSelect96孔细胞侵袭检测（I型胶原，荧光法）

CytoSelect 96孔细胞侵袭检测试剂盒组成（室温运输）：

1.96孔ECM侵袭板（部件编号11201）：一个含有ECM涂覆插入物的无菌96孔板（见图1了解组件）。

2.96孔细胞收获托盘（部件编号10402）：一个96孔托盘。

3.细胞分离液（部件编号10403）：一瓶20毫升。

4.4倍裂解缓冲液（部件编号10404）：一瓶10毫升。

5.CyQuant®GR染料（部件编号10105）：一个75微升的管。

未提供材料

1.侵袭性细胞系

2.细胞培养基

3.无血清培养基，例如含有0.5%BSA、2mMCaCl₂和2mMMgCl₂的DMEM

4.细胞培养箱（37°C，5%CO₂环境）

5.显微镜

6.96孔微量滴定板

7.微量滴定板读数器

储存

将所有组分储存于4°C。  

结果示例：  

下图显示了CytoSelect™细胞侵袭检测试剂盒的典型情况。以下数据仅供参考。这些数据不应用于解释实际结果。

HT-1080细胞在细胞分离缓冲液中进行梯度稀释，随后用4倍裂解缓冲液/CyQuant® GR染料进行裂解和检测（150 µL细胞悬浮液与50 µL 4倍裂解缓冲液/染料混合）。

HT-1080或NIH3T3细胞被允许向10%胎牛血清（FBS）方向侵袭24小时，实验中加入或不加入2 µM细胞松弛素D，每次实验使用200,000个细胞。侵入聚碳酸酯膜底部的细胞被染色（见图），并按照实验方案中描述的方法用CyQuant® GR染料进行定量分析。

CytoSelect 96孔细胞侵袭检测试剂盒文献参考：

1. Erkell, L. J., Schirrmacher, V. (1988) Cancer Res 48, 6933-6937.

2. Montgomery, A. M. P., De Clerck, Y. A., Langley, K. E., Reisfeld, R. A., Mueller, B. M. (1993)Cancer Res 53,693-700.

3. Monsky, W. L., Lin, C. Y., Aoyama, A., Kelly, T., Akiyama, S. K., Mueller, S. C., Chen, W. T.(1994) Cancer Res 54,5702-5710.

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QuickTiter腺病毒滴度检测试剂盒-快速定量病毒上清液的腺病毒滴度

重组腺病毒在研究和治疗应用中具有巨大的潜力。它们在将遗传物质引入宿主细胞时提供了诸多优势，宿主细胞范围非常广泛。该病毒已被用于感染许多哺乳动物细胞类型（包括增殖性和非增殖性细胞），以实现重组蛋白的高效表达。重组腺病毒尤其适用于那些通过脂质体转染效率较低的细胞系中的基因转移和蛋白表达。病毒进入细胞后，保持染色体外状态（即不整合到宿主染色体中，因此不会激活或失活宿主基因）。最近，重组腺病毒已被用于将RNAi导入细胞。

HEK293细胞或其变体被用作病毒扩增的宿主细胞。重组腺病毒可以在高滴度下生长（10¹⁰病毒颗粒/mL，可浓缩至10¹³病毒颗粒/mL），并可通过CellBiolabs的ViraBind™腺病毒纯化试剂盒或传统的CsCl超速离心法进行纯化。

通过病毒载体传递基因的一个特别挑战是准确测量病毒滴度。传统上，通过培养中的噬菌斑形成单位（PFU）测定感染性颗粒，该方法根据稀释度计算病毒噬菌斑的数量。其他方法则利用抗体通过免疫组化染色或流式细胞术（FACS）分析识别腺病毒六邻体蛋白。这些方法耗时较长，需要较长的感染周期，且存在较高的实验间差异，并受病毒-细胞相互作用的影响。对于高纯度病毒样本，可通过260nm的光吸收度估算病毒颗粒的总数。然而，这种方法不能用于未纯化的病毒上清液，因为其中的某些成分会对260nm的光吸收度产生贡献。

艾美捷QuickTiter腺病毒滴度检测试剂盒（#VPK-106）不涉及细胞感染，而是特异性地测量纯化病毒或未纯化病毒上清液样本中的病毒核酸含量。特别是对于未纯化的病毒上清液，该试剂盒在纯化步骤之前确定上清液滴度方面非常有用。试剂盒的检测灵敏度下限为1×10⁹病毒颗粒或1×10¹⁰病毒颗粒/mL（当使用100µL腺病毒上清液进行检测时），这对于中高滴度的腺病毒样本是足够的。整个过程大约需要45到60分钟。每套试剂盒提供足够的试剂，可进行多达20次病毒样本和对照的检测。

QuickTiter™腺病毒定量试剂盒为纯化病毒和病毒上清液的腺病毒滴度快速定量提供了一个高效的系统。

相关产品：

1.AD-100：293AD细胞系

2.AD-200：ViraDuctin™腺病毒转导试剂

3.VPK-099：ViraBind™腺病毒小量纯化试剂盒

4.VPK-109：QuickTiter™腺病毒滴度免疫测定试剂盒

5.VPK-110：QuickTiter™腺病毒滴度ELISA试剂盒

6.VPK-111：快速RCA测定试剂盒

7.VPK-252：RAPAd®CMV腺病毒表达系统

QuickTiter腺病毒滴度检测试剂盒组成（蓝色冰袋运输）：

1.QuickTiter™溶液A（部件编号40020）：一瓶，200µL。

2.QuickTiter™腺病毒捕获溶液（部件编号40021）：一瓶，1.0mL。

3.QuickTiter™溶液B（10倍）（部件编号40022）：两瓶，每瓶1.8mL。

4.QuickTiter™溶液C（2倍）（部件编号40023）：两瓶，每瓶1.5mL。

5.CyQuant®GR染料（400倍）（部件编号105101）：一瓶，50µL。

6.QuickTiter™腺病毒DNA标准品（部件编号40025）：一瓶，500µL，含100µg/mL腺病毒DNA标准品。

未提供材料：

1.感兴趣的重组腺病毒：纯化或未纯化的高滴度病毒上清液

2.HEK293细胞及细胞培养生长培养基

3.细胞培养离心机

4.0.45µm滤膜

5.含10mMMgCl₂、1mMCaCl₂的1倍PBS

6.1倍TE（10mMTris，pH7.5，1mMEDTA）

7.荧光酶标仪

储存：

将所有试剂盒组分储存于4°C。

安全注意事项：

请记住，您将处理含有感染性病毒的样本。请遵循NIH推荐的针对BSL-2生物体的所有材料的指南。

结果示例：

以下图表展示了典型的定量结果。以下数据仅供参考，不应用于解释实际结果。 

图1：腺病毒DNA标准曲线。QuickTiter™腺病毒DNA标准品按照上述说明进行稀释。使用MolecularDevice的SpectraMaxGeminiXS荧光计（带485/538nm滤光片组和530nm截止滤光片）进行荧光测量。

QuickTiter腺病毒滴度检测试剂盒文献参考：

1. Wu N and Ataai M. M (2000) Curr Opin Biotechnol. 11(2):205-8.

2. Mizuguchi et al., (2001) Advanced Drug Delivery Reviews 52:165–176.

3. Vorburger, S. A. and Hunt, K. K. (2002) Oncologist 7:46–59.

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脂质提取试剂盒(无氯仿)检测的典型结果分析

脂质是一类多样化的分子，包括单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油、脂肪、甾醇等。脂质不仅定义和维持细胞膜的完整性，还参与细胞过程，如膜运输、信号转导、细胞凋亡和能量储存。脂质代谢的紊乱与多种疾病有关，如癌症、糖尿病、阿尔茨海默病和冠心病。

为了研究脂质，通常需要首先从组织或培养细胞中提取它们。传统上，Folch方法（参考文献1）的有机提取是首选，但这种方法存在几个缺点。首先，它将脂质提取到底部有机相中，在纯化过程中，上层含蛋白质的相会穿透到底部，导致脂质样本受到污染。因此，低纯度的脂质样本可能会因堵塞仪器（如高效液相色谱仪）而阻碍下游脂质分析。此外，Folch方法使用氯仿作为有机相溶剂。长期吸入氯仿会导致肝脏受损，如肝炎和黄疸。此外，氯仿已被证明在动物中具有致癌性，导致肾脏和肝脏肿瘤增加。事实上，美国环境保护署（EPA）已将氯仿归类为B2组，可能的人类致癌物。

艾美捷脂质提取试剂盒(无氯仿)（#STA-612）通过有机提取分离总脂质，但通过将脂质提取到上层有机相（使其适用于高通量提取）并避免使用氯仿，从而避免了上述缺点。将粗脂质来源（如血清或组织培养细胞沉淀）重悬于专有的酒精中。加入专有的有机化合物后，混合物通过离心分离各相。回收的上层有机相随后干燥并重悬，用于下游脂质分析。每套试剂盒提供足够的试剂，可分离多达50个样本（基于100 µL样本量）。可以使用更大的样本量（见表1），但每套试剂盒的分离次数会相应减少。

脂质提取试剂盒(无氯仿)相关产品：

1. STA-613：脂质定量试剂盒（比色法）

2. STA-369：OxiSelect™人氧化LDL ELISA试剂盒（MDA-LDL定量）

3. STA-384：总胆固醇测定试剂盒（比色法）

4. STA-391：HDL和LDL/VLDL胆固醇测定试剂盒

5. STA-394：HDL胆固醇测定试剂盒

6. STA-396：血清三酰甘油定量试剂盒（比色法）

7. STA-398：游离甘油测定试剂盒（比色法）

8. STA-618：游离脂肪酸测定试剂盒（比色法）

9. STA-600：磷脂酰胆碱测定试剂盒

试剂盒组成（室温运输）：

1. 脂质提取试剂A（部件编号261201）：一瓶25 mL琥珀色玻璃瓶。

2. 脂质提取试剂B1（部件编号261204）：两瓶30 mL琥珀色玻璃瓶。

3. 脂质提取试剂B2（部件编号261205）：一瓶20 mL琥珀色玻璃瓶。

4. 脂质提取试剂C（部件编号261203）：一瓶25 mL。

未提供材料：

1. 玻璃管、15 mL锥形管或微量离心管

2. 10 µL至1000 µL可调单通道移液器及一次性吸头

3. 50 µL至1000 µL可调多通道移液器及一次性吸头

4. 多通道移液器储液槽

5. 磷酸盐缓冲液（PBS）

6. 试管涡旋器

7. 有机溶剂（如氯仿、丁醇或环己烷）

储存：

将整个试剂盒储存于室温。为避免可能的泄漏，请将瓶子直立存放。

试剂准备：

- 脂质提取试剂B：将3份脂质提取试剂B1与1份脂质提取试剂B2在琥珀色玻璃瓶中混合。充分混合后，保存于避光处，直至使用。

样本准备：

- 血浆：用抗凝剂（如柠檬酸、EDTA、肝素或草酸盐）收集血液，并通过翻转混合。在4°C下以1000 x g离心10分钟。收集血浆上清液，避免干扰白色白细胞层。样本应立即提取，或在-80°C下保存。

- 血清：在无抗凝剂的试管中收集血液。让血液在室温下凝固30分钟。以2500 x g离心20分钟。小心移除黄色血清上清液，避免干扰白色白细胞层。样本应立即提取，或在-80°C下保存。

- 培养细胞：将5-10×10⁶个细胞以1000 x g离心5分钟。用1X PBS洗涤细胞一次，最后将细胞沉淀重悬于100 µL 1X PBS中。按照试剂盒协议进行提取。

- 组织：小心地用手术刀/剃刀片将组织切成小块，并在50 mL锥形管中称重。加入PBS，使组织浓度达到2 mg/mL。在4°C下匀浆组织。按照试剂盒协议从全组织匀浆中进行提取。

结果示例：

以下图表展示了使用脂质提取试剂盒制备的样本进行的各种检测的典型结果。以下数据仅供参考，不应用于解释实际结果。

图1：总胆固醇测定（产品编号STA-390）

(A) 胆固醇标准曲线。

(B) 使用Folch方法（蓝色条）或无氯仿的脂质提取试剂盒（红色条）从胎牛血清（FBS）或HEK293细胞中提取的脂质，根据检测协议检测胆固醇的存在。

图2：游离脂肪酸测定（产品编号STA-619）

(A) 游离脂肪酸（FFA）标准曲线。

(B) 使用Folch方法（蓝色条）或无氯仿的脂质提取试剂盒（红色条）从胎牛血清（FBS）或HEK293细胞中提取的脂质，根据检测协议检测游离脂肪酸的存在。

脂质提取试剂盒(无氯仿)文献参考：

1. Folch J, Lees M, and Slone Stanley GH (1956) J. Biol. Chem. 226, 497-509.

2. Iverson SJ, Lang SLC, and Cooper MH (2001) J. Lipid Res. 36, 1283-1287.

3. Bang DY, Byeon SK, Moon MH (2014) J. Chromatogr A. 28, 1331

4. Reis A, Rudnitskaya A, Blackburn GJ, Mohd Fauzi N, Pitt AR, Spickett CM (2013) J. Lipid Res.,

54, 1812-1824.

https://www.amyjet.com/products/STA-612.shtml

α-酮戊二酸测定试剂盒(比色法)，可提供进行多达100次检测

α-酮戊二酸（α-KG，或称2-氧代戊二酸）是一种在多种代谢途径中具有多种作用的重要分子。α-KG通过异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸的氧化脱羧生成，同时也是通过谷氨酸脱氢酶催化谷氨酸脱氨基生成的酮酸产物。α-酮戊二酸在三羧酸（TCA）循环中作为细胞能量代谢的关键中间体发挥作用。通过谷氨酸脱氢酶从谷氨酸生成α-酮戊二酸的补充反应可以为循环补充燃料。

α-酮戊二酸作为一种氮运输分子，促进氨基酸合成，同时抑制肌肉中的蛋白质降解。L-丙氨酸或L-天冬氨酸可以通过转氨酶（如丙氨酸氨基转移酶（ALT）或天冬氨酸氨基转移酶（AST））与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，这是氮的利用和排泄的基础。氨基酸的氨基团附着在α-KG上，随后被运输到肝脏并进入尿素循环。这些转氨基和脱氨基途径对于氨的解毒以及神经递质谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）的形成也非常重要。

α-酮戊二酸的其他特性包括通过清除过氧化氢积累并促进其消除发挥抗氧化活性。它还通过氧化脱羧生成ATP，为肠道细胞过程和氧化还原平衡提供能量。该分子还可以影响脯氨酸的羟基化，增加胶原蛋白和骨基质的形成。最近，α-KG被发现可以延长细胞寿命并延缓与年龄相关的疾病（见图1）。

图1：α-酮戊二酸对多种细胞功能的影响

艾美捷α-酮戊二酸测定试剂盒(比色法)（#MET-5131）是一种简单的比色法检测方法，可在96孔微量滴定板格式中测量血浆、血清、组织匀浆或细胞悬浮液中存在的α-酮戊二酸活性。每套试剂盒提供足够的试剂进行多达100次检测（包括空白、标准品和样本）。试剂盒的检测灵敏度下限约为3.9 µM α-酮戊二酸。

注意：样本中存在的丙酮酸可能会产生背景信号。如果您的测试样本中含有丙酮酸，请对每个样本进行两次检测。将一个样本反应与α-KG反应转换剂处理，另一个不处理（负对照反应混合物中将加入1X检测缓冲液代替α-KG反应转换剂）。α-酮戊二酸的浓度通过两个孔的吸光度（OD）读数差异计算得出。

α-酮戊二酸测定试剂盒(比色法)检测原理：

Cell Biolabs的α-酮戊二酸检测试剂盒通过偶联酶促反应测量α-酮戊二酸。α-酮戊二酸通过转氨基作用生成丙酮酸，随后通过比色探针检测丙酮酸。样本和标准品孵育60-120分钟后，使用标准96孔酶标仪（540-570 nm）读取结果。样本与96孔微量滴定板格式中的已知浓度α-酮戊二酸标准品进行比较。

α-酮戊二酸测定试剂盒(比色法)相关产品：

1. MET-5012：乳酸检测试剂盒（比色法）

2. MET-5022：糖原检测试剂盒（比色法）

3. MET-5054：L-氨基酸检测试剂盒（比色法）

4. MET-5088：谷氨酸检测试剂盒（比色法）

5. MET-5123：丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性检测试剂盒（比色法）

试剂盒组成：

盒子1（蓝色冰袋运输）：

1. α-KG反应转换剂（部件编号51323C）：两支500 µL试管。

2. α-酮戊二酸标准品（部件编号51321C）：一支100 µL试管，100 mM溶液。

3. α-KG酶混合物（部件编号51324C）：两支100 µL琥珀色试管。

4. 比色探针（部件编号51231C）：两支100 µL琥珀色试管。

5. HRP（部件编号234402）：一支100 µL试管，含100 U/mL的甘油溶液。

盒子2（蓝色冰袋运输）：

1. 10倍检测缓冲液（部件编号50292A）：一瓶25 mL。

2. α-KG底物混合物（部件编号51322B）：两支500 µL试管。

未提供材料：

1. 蒸馏水或去离子水。

2. 10 kDa截留分子量离心过滤器（例如Amicon Ultra 0.5 mL）（可选，用于高蛋白含量样本）。

3. 1倍PBS。

4. 标准96孔微量滴定板。

储存：

收货后，将α-KG底物混合物和10倍检测缓冲液储存于4°C。其余组分储存于-20°C。

检测步骤：

每次检测时，每个α-酮戊二酸标准品、对照品和样本均需进行双份或三份检测，并使用新制备的标准曲线。

注意：样本中存在的丙酮酸可能会产生背景信号。如果您的测试样本中含有丙酮酸，请对每个样本进行两次检测。将一个样本反应与α-KG反应转换剂处理，另一个不处理（负对照反应混合物中将加入1X检测缓冲液代替α-KG反应转换剂）。α-酮戊二酸的浓度通过两个孔的吸光度（OD）读数差异计算得出。

1. 向96孔微量滴定板的每个孔中加入50 µL稀释后的α-酮戊二酸标准品、阳性对照或样本。

2. 向样本和一对样本孔的一半加入150 µL准备好的反应试剂，并充分混合孔内内容物。

3. 向剩余的一对样本孔的另一半加入150 µL准备好的阴性对照反应试剂，并充分混合孔内内容物。

4. 在37°C下避光孵育60-120分钟。

 注意：本检测为连续反应（未终止），因此可以在多个时间点进行测量以跟踪反应动力学。

5. 使用540-570 nm的酶标仪读取结果。

α-酮戊二酸测定试剂盒(比色法)文献参考：

1. Hammerqvist, F., et al. (1991) Surgery 109: 28-36.

2. He, L., et al. (2015) Curr. Protein Pept. Sci. 16: 576-581.

3. Hou, Y.Q., et al. (2010) Front Biosci. 16: 1186-1196.

4. Tatara M., et al. (2005) Poult. Sci. 84(10): 1604-1609.

5. Yao, K., et al. (2012) Amino Acids 42: 2491-2500.

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总胆固醇检测试剂盒(比色法)检测原理及试剂准备方案

胆固醇是一种在真核生物中产生并运输到全身的脂质甾醇。胆固醇是细胞膜结构、激素和细胞信号传导中使用的关键化合物。它是动物细胞结构中维持通透性和流动性的必需成分。胆固醇是类固醇激素的前体，包括肾上腺皮质激素（如皮质醇和醛固酮）、性激素（如孕酮、雌激素和睾酮）、胆汁酸和维生素D。胆固醇通过脂蛋白在体内运输，这些脂蛋白具有细胞特异性信号，指导它们运输的脂质到达特定组织。因此，脂蛋白根据其密度在血液中以不同形式存在，包括乳糜微粒、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）、中间密度脂蛋白（IDL）和高密度脂蛋白（HDL）。脂蛋白中的脂质含量越高，其密度越低。胆固醇在脂蛋白中以游离醇和胆固醇酯的形式存在，其中胆固醇酯是胆固醇运输和储存的主要形式。

确定循环脂蛋白水平对于诊断脂质运输障碍至关重要。高水平的胆固醇和胆固醇酯（高胆固醇血症）与心血管疾病（如动脉粥样硬化和心脏病）有关，尽管低水平（低胆固醇血症）可能与癌症、抑郁或呼吸系统疾病有关。

艾美捷总胆固醇检测试剂盒(比色法)（#STA-384）是一种简单的比色法检测方法，可在96孔微量滴定板格式中测量血浆、血清、组织匀浆或细胞裂解液中的总胆固醇含量。该检测可在胆固醇酯酶存在的情况下检测总胆固醇（胆固醇酯+游离胆固醇），或在没有酯酶酶的情况下仅检测游离胆固醇。每套试剂盒提供足够的试剂进行多达192次检测，包括空白、胆固醇标准品和未知样本。通过与已知浓度的胆固醇标准品比较，确定样本中的胆固醇浓度。通过从总胆固醇值中减去游离胆固醇值，可以定量胆固醇酯。

总胆固醇检测试剂盒(比色法)检测原理：

Cell Biolabs的总胆固醇检测试剂盒通过酶促反应定量血清、血浆、裂解液或组织样本中的总胆固醇。胆固醇酯通过胆固醇酯酶水解为胆固醇，随后被胆固醇氧化酶氧化为酮类化合物（胆固醇-4-烯-3-酮）和过氧化氢。过氧化氢随后通过高特异性的比色探针检测。辣根过氧化物酶催化探针与过氧化氢之间的反应，二者以1:1的比例结合。样本与已知浓度的胆固醇标准品在96孔微量滴定板格式中进行比较。样本和标准品孵育45分钟后，使用标准96孔比色法酶标仪（见图1）读取结果。

图1：比色法胆固醇检测原理

相关产品：

1. STA-367：人载脂蛋白E ELISA试剂盒

2. STA-369：OxiSelect™人氧化LDL ELISA试剂盒（MDA-LDL定量）

3. STA-390：总胆固醇检测试剂盒（荧光法）

4. STA-391：HDL和LDL/VLDL胆固醇检测试剂盒

总胆固醇检测试剂盒(比色法)组成：

盒子1（室温运输）：

1. 胆固醇标准品（部件编号239001）：一支50 µL管，含10 mM乙醇溶液中的胆固醇。

2. 检测稀释液（5倍）（部件编号239002）：一瓶100 mL。

3. 50倍比色探针（部件编号238401）：一支200 µL管，溶于DMSO中。

4. 辣根过氧化物酶（部件编号234402）：两支100 µL管，含100 U/mL甘油溶液中的辣根过氧化物酶。

盒子2（蓝色冰袋运输）：

1. 胆固醇酯酶（部件编号239003）：一支管，含10单位酶的粉末。

2. 胆固醇氧化酶（部件编号239004）：一支200 µL管。

未提供材料：

1. 96孔微量滴定板

2. 蒸馏水或去离子水

3. 1倍PBS

4. 10 µL至1000 µL可调单通道移液器及一次性吸头

5. 50 µL至300 µL可调多通道移液器及一次性吸头

6. 多通道移液器储液槽

7. 能在540-570 nm吸光度范围内读取的分光光度酶标仪

8. 超氧化物歧化酶（可选）

储存：

收货后，将检测稀释液储存于4°C。其余试剂盒组分储存于-20°C。50倍比色探针对光敏感，必须相应储存。避免多次冻融循环。

试剂准备：

- 1倍检测稀释液：在使用前将检测稀释液（5倍）平衡至室温。用去离子水稀释检测稀释液（5倍），将100 mL稀释液与400 mL去离子水混合，总体积为500 mL。混合均匀。将1倍检测稀释液储存于4°C，最长可达六个月。

- 胆固醇酯酶：用200 µL 1倍检测稀释液重悬粉末。剧烈涡旋直至溶解。分装后储存于-20°C，以避免重悬粉末的多次冻融。

- 胆固醇反应试剂：通过在1倍检测稀释液中稀释胆固醇氧化酶1:50、辣根过氧化物酶1:50、比色探针1:50和胆固醇酯酶1:250来制备试剂。（例如，对于100次检测，将100 µL胆固醇氧化酶、100 µL辣根过氧化物酶、100 µL比色探针和20 µL胆固醇酯酶与1倍检测稀释液混合至5 mL总体积）。混合均匀并避光保存。为获得最佳结果，将胆固醇反应试剂置于冰上，并在制备后30分钟内使用。不要储存胆固醇反应试剂溶液。

注意：

1. 如果仅需要检测游离胆固醇浓度，请从胆固醇反应试剂溶液中省略胆固醇酯酶的添加。

2. 比色探针对光敏感，必须相应储存。

检测步骤：

每次检测时，每个胆固醇标准品和样本均需进行双份或三份检测，并使用新制备的标准曲线。

1. 向96孔微量滴定板中加入50 µL稀释后的胆固醇标准品或样本。

2. 向每个孔中加入50 µL准备好的胆固醇反应试剂，并充分混合孔内内容物。

3. 覆盖孔以保护反应免受光照。在37°C下孵育45分钟。

4. 立即使用分光光度酶标仪在540-570 nm范围内读取结果。

5. 通过将样本吸光度值与胆固醇标准曲线比较，计算样本中的胆固醇浓度。

总胆固醇检测试剂盒(比色法)文献参考：

1. Admundson, D.M., et al. (1999) J. Biochem. Biophys. Meth. 38: 43-52.

2. Cholesterol and Triglyceride concentrations in Serum/Plasma Pairs. (1977) Clin. Chem. 23: 60-63.

3. Fossati, P., et al. (1982) Clin. Chem. 28: 2077-2080.

4. Ledwozyw, A., et al. (1986) Clin. Chim. Acta. 155: 275-284.

5. Lee, S.M. et al. (2008) Lipids 43: 419-429.

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96孔板ROCK活性检测试剂盒，检测ROCK对MYPT1在Thr696位点的特异性磷酸化

Rho家族成员是信号通路中的关键调控组分，通过重排肌动蛋白细胞骨架来指导细胞运动、黏附和细胞分裂。Rho通过细胞外信号（如溶血磷脂酸，LPA）激活。Rho的作用通过下游Rho效应分子介导，其中一种效应分子是Rho相关激酶（ROCK）。目前已鉴定出两种ROCK亚型：ROCK-I（也称为ROKβ）和ROCK-II（也称为Rho激酶和ROKα）。ROCK通过磷酸化多个底物介导Rho信号传导，并重排肌动蛋白细胞骨架，这些底物有助于肌动蛋白丝的组装和收缩性。例如，ROCK通过特异性磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶标亚基1（MYPT1）的Thr696位点使肌球蛋白磷酸酶失活，从而导致20 kDa肌球蛋白轻链（MLC20）的磷酸化含量增加。

Cell Biolabs的96孔ROCK活性检测试剂盒是一种酶免疫测定法，用于检测ROCK对MYPT1在Thr696位点的特异性磷酸化。该试剂盒的微孔板预先涂覆了重组MYPT1。将底物孔与ROCK样本（如纯化的激酶、细胞或组织裂解液）孵育后，通过抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗体检测磷酸化的MYPT1。

艾美捷96孔板ROCK活性检测试剂盒（#STA-416）提供了一种非同位素、灵敏且特异的方法，用于通过其生理底物监测ROCK活性；它也可用于筛选ROCK抑制剂。试剂盒的检测灵敏度下限为200 pg活性ROCK-II。试剂盒还提供了重组活性ROCK-II作为阳性对照。每套试剂盒提供足够的试剂进行多达96次检测。

相关产品：

1. STA-415：ROCK活性免疫印迹试剂盒

2. STA-400：Ras激活检测试剂盒

3. STA-404：Rac/Cdc42激活检测试剂盒组合

4. STA-405：Rho/Rac/Cdc42激活检测试剂盒组合

5. STA-410：PAK1 PBD琼脂糖珠

96孔板ROCK活性检测试剂盒组成：

盒子1（室温运输）：

1. ROCK底物涂覆板（部件编号241601）：一个预先涂覆重组MYPT1的96孔板。

2. 10倍激酶缓冲液（部件编号241602）：一瓶20 mL，含250 mM Tris（pH 7.5）、100 mM MgCl₂、50 mM甘油-2-磷酸、1 mM Na₃VO₄。

3. ATP溶液（部件编号241604）：一瓶100 µL，含100 mM ATP。

4. 抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗体（部件编号241603）：一瓶20 µL。

5. 二抗，辣根过氧化物酶偶联物（部件编号231009）：一瓶20 µL。

6. 检测稀释液（部件编号310804）：一瓶50 mL。

7. 10倍洗液（部件编号310806）：一瓶100 mL。

8. 底物溶液（部件编号310807）：一瓶12 mL，棕色瓶。

9. 终止液（部件编号310808）：一瓶12 mL。

盒子2（蓝色冰袋运输）：

1. 活性ROCK-II（部件编号241505）：一瓶20 µL，含10 ng活性ROCK-II，溶于25 mM Tris（pH 7.5）、10 mM MgCl₂、5 mM甘油-2-磷酸、0.1 mM Na₃VO₄、10%甘油、0.1% BSA。

未提供材料：

1. ROCK样本（纯化的激酶、细胞或组织裂解液）。

2. 裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM甘油-2-磷酸、1% Triton X-100或1% Nonidet P-40、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM Na₃VO₄和蛋白酶抑制剂。

3. DTT。

4. 0.5 M EDTA。

5. 30°C恒温箱或水浴。

6. 能在450 nm（620 nm作为可选参考波长）读取的酶标仪。

储存：

将活性ROCK-II储存于-80°C，ATP溶液储存于-20°C，其余试剂盒组分储存于4°C。避免多次冻融循环。

结果示例：

以下图表展示了使用Cell Biolabs的96孔ROCK活性检测试剂盒获得的典型结果。以下数据仅供参考。

图1：ROCK-II活性检测

左图：活性ROCK-II在30°C下孵育60分钟。

右图：2.5 ng活性ROCK-II在30°C下按所示时间孵育。通过抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗体检测MYPT1底物的磷酸化，具体方法见检测协议。

图2：ROCK-II活性免疫印迹检测

将含有10 ng活性ROCK-II的1倍激酶缓冲液（25 µL）与含有0.2 mM ATP和500 ng重组MYPT1的1倍激酶缓冲液（50 µL）在30°C下孵育30分钟。通过加入25 µL 4倍SDS-PAGE样品缓冲液终止激酶反应。泳道1、3、5、7：无激酶（阴性对照）；泳道2、4、6、8：有激酶。将200 ng（泳道1和2）、100 ng（泳道3和4）、50 ng（泳道5和6）或25 ng（泳道7和8）的重组MYPT1底物加载到SDS-PAGE上。通过抗磷酸化MYPT1（Thr696）抗体检测MYPT1底物的磷酸化，具体方法见产品编号STA-415的检测协议。

96孔板ROCK活性检测试剂盒文献参考：

1. Etienne-Manneville, S., and Hall, A. (2002) Nature 420, 629-635.

2. Riento, K., and Ridley, A. J. (2003) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4, 446-456.

3. Leung, T., Manser, E., Tan, L., and Lim, L. (1995) J. Biol. Chem. 270, 29051-29054.

4. Matsui, T., Amano, M., Yamamoto, T., Chihara, K., Nakafuku, M., Ito, M., Nakano, T., Okawa,

K., Iwamatsu, A., and Kaibuchi, K. (1996) EMBO J. 15, 2208-2216.

5. Totsukawa, G, et al., J. Cell Biol. (1999) 144, 735-744.

https://www.amyjet.com/products/STA-416.shtml