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iFluor488-dUTP：AAT高效荧光标记核苷酸
染料修饰的脱氧尿苷5'-三磷酸盐是通过常规酶掺入方法（如逆转录、缺口翻译、随机引物标记或PCR）生产染料标记DNA的最常见方法之一。这种酶荧光标记方法广泛用于FISH探针和基于微阵列的实验。这种iFluor 488 dUTP缀合物使用SpectrumGreen™滤光片组作为绿色荧光色（SpectrumGreen®是Vysis的商标）。与常用的绿色探针（如荧光素-12-dUTP）相比，iFluor 488提供了更亮的信号，具有更强的光稳定性，不受pH值的影响。
艾美捷iFluor488-dUTP：
货号 AAT-17039
单位大小 100纳摩尔、25纳摩尔、100纳摩尔
分子量 1152.83
溶剂 水
危害语句代码 H303, H313, H333
危害标识符 XN
预期用途 仅供研究使用（RUO）
风险语句代码 R20, R21, R22
储存条件 冷冻（<-15°C）；尽量减少光照
图：荧光素和iFluor®488 dUTP标记的端粒探针在中期HeLa细胞中的荧光原位杂交。
iFluor488-dUTP文献参考：
Anti-proliferative effect of Fe(III) complexed with 1-(2-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)-4-aminosalicylhydrazone in HepG2 cells.
Authors: Fukushima, Takeshi and Taniguchi, Erina and Yamada, Hiroshi and Kato, Kiyomasa and Shimizu, Ayako and Nishiguchi, Yoshikazu and Onozato, Mayu and Ichiba, Hideaki and Azuma, Yutaro
Journal: Biometals : an international journal on the role of metal ions in biology, biochemistry, and medicine (2015): 669-77
Localisation of abundant and organ-specific genes expressed in Rosa hybrida leaves and flower buds by direct in situ RT-PCR.
Authors: Jedrzejuk, Agata and Mibus, Heiko and Serek, Margrethe
Journal: TheScientificWorldJournal (2012): 609597
SNP genotyping using microsphere-linked PNA and flow cytometric detection.
Authors: Rockenbauer, Eszter and Petersen, Kenneth and Vogel, Ulla and Bolund, Lars and Kølvraa, Steen and Nielsen, Kirsten Vang and Nexø, Bjørn A
Journal: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology (2005): 80-6
[Comparative genomic hybridization analysis of nasopharyngeal carcinoma drug-resistant cell CNE2/DDP and its parent cell CNE2].
Authors: Jiang, Run-De and Hu, Liang and Guan, Xin-Yuan and Zhang, Li-Xin and Yue, Wen and Cen, Xin-Tang and Li, Chun-Hai
Journal: Ai zheng = Aizheng = Chinese journal of cancer (2004): 386-90
Flow cytometric detection of beta-D-glucuronidase gene in wild-type bacterial cells using in-situ PCR.
Authors: Sachidanandham, Ramaiah and Gin, Karina Yew-Hoong
Journal: Biotechnology and bioengineering (2003): 127-33
相关产品：
iFluor A7 SE
iFluor 350 maleimide
iFluor 555 maleimide
https://www.amyjet.com/products/AAT-17039.shtml
鬼笔环肽-iFluor 555偶联物，高分辨率研究肌动蛋白在细胞中的分布
这种橙色的荧光鬼笔环肽缀合物（相当于Alexa Fluor®555标记的鬼笔环蛋白）选择性结合F-actins。以纳摩尔浓度使用，鬼笔环肽衍生物是标记、鉴定和定量甲醛固定和渗透组织切片、细胞培养或无细胞实验中F-actins的方便探针。Phalloidin与肌动蛋白丝的结合比与肌动蛋白单体的结合更紧密，导致肌动蛋白亚基从丝端解离的速率常数降低，基本上通过防止丝解聚来稳定肌动蛋白丝。此外，发现鬼笔环肽抑制F-actin的ATP水解活性。Phalloidin在细胞中不同浓度下的作用不同。当以低浓度引入细胞质时，鬼笔环肽将聚合程度较低的细胞质肌动蛋白和丝蛋白募集到聚集的肌动蛋白聚合物的稳定“岛”中，但它不会干扰应力纤维，即粗的微丝束。鬼笔环肽的性质是一种有用的工具，可以通过用荧光类似物标记鬼笔环蛋白并将其用于在光学显微镜下染色肌动蛋白丝来研究F-肌动蛋白在细胞中的分布。鬼笔环肽的荧光衍生物已被证明在活细胞或固定细胞中定位肌动蛋白丝以及在体外可视化单个肌动蛋白丝方面非常有用。荧光鬼笔环肽衍生物已被用作高分辨率研究肌动蛋白网络的重要工具。AAT Bioquest提供各种不同颜色的荧光鬼笔环肽衍生物，用于多色成像应用。
货号 AAT-23119
偶联物：iFluor 555
单位大小：300次测试
目录编号：23100、23101、23102、23103、23110、23111、23115、23116、23117、23119、23122、23125
分子量：~1300
溶剂：DMSO
校正因子（260纳米）：0.23
校正因子（280纳米）：0.14
消光系数（cm -1 M -1）：100000
激发（纳米）：557
发射（纳米）：570
量子产率：0.64
预期用途：仅供研究使用（RUO）
储存条件：冷冻（<-15°C）；尽量减少光照
协议概要：
在微孔板孔中准备样品
从板中的样品中移除液体
加入Phalloidin-iFluor™ 555偶联溶液（每孔100 μL）
在室温下对细胞进行20至90分钟的染色
洗涤细胞：
在显微镜下使用TRITC滤光片检查样本
重要事项 在打开前将瓶加热至室温并短暂离心。
储存和处理条件：
如果储存在-20°C，溶液至少稳定6个月。保护荧光偶联物不受光线影响，并避免冻融循环。
注意 Phalloidin有毒，尽管一瓶中的毒素量可能只对蚊子致命（Phalloidin的LD50 = 2 mg/kg），应小心处理。
工作溶液的准备：
Phalloidin-iFluor™ 555偶联工作溶液
将1 μL的Phalloidin-iFluor™ 555偶联溶液加入到含1% BSA的PBS中，制成1 mL的工作溶液。
注意 Phalloidin偶联物的库存溶液应分装并储存在-20°C，避免光线照射。
注意 不同细胞类型可能染色不同。应相应准备Phalloidin偶联工作溶液的浓度。
样品实验协议
染色细胞：
进行甲醛固定。在室温下用含3.0-4.0%甲醛的PBS孵育细胞10-30分钟。
注意 避免使用含甲醇的固定剂，因为甲醇可能会在固定过程中破坏肌动蛋白。首选的固定剂是无甲醇的甲醛。
用PBS冲洗固定细胞2-3次。
可选：将0.1% Triton X-100加入PBS中，用于固定细胞3至5分钟以增加通透性。用PBS冲洗细胞2-3次。
将Phalloidin-iFluor™ 555偶联工作溶液（100 μL/孔，96孔板）加入到固定细胞中，并在室温下对细胞进行20至90分钟的染色。
在将细胞板封盖和在显微镜下使用TRITC滤光片组进行成像之前，用PBS轻轻冲洗细胞2至3次以去除多余的Phalloidin偶联物。
图：用4%甲醛固定的HeLa细胞的荧光图像，然后分别用Phalloidin iFluor®555偶联物（Cat#23119，红色）和Nuclear Blue™DCS1（Cat#17548，蓝色）染色。
鬼笔环肽-iFluor 555偶联物文献参考：
LSD1 deficiency in breast cancer cells promotes the formation of pre-metastatic niches
Authors: Yao, Yutong and Qian, Rui and Gao, Hanwei and Dai, Yonghao and Shi, Yueru and An, Peipei and Xin, Benkai and Liu, Ziyu and Zhang, Nan and Wan, Youzhong and others,
Journal: npj Precision Oncology (2024): 260
ROS-Responsive and Self-Catalytic Nanocarriers for a Combination of Chemotherapy and Reinforced Ferroptosis against Breast Cancer
Authors: Zhang, Beibei and Liu, Hao and Wang, Yifei and Zhang, Yong
Journal: ACS Biomaterials Science \& Engineering (2024)
LSD1 inhibits the invasion and migration of breast cancer through exosomes
Authors: Zhang, Nan and Chen, Zhongyu and Xin, Benkai and Shi, Yueru and Yao, Yutong and Yang, Jingtong and Wang, Xiaoyu and Hu, Xin
Journal: Scientific Reports (2024): 20817
Meis1 Targets Protein Tyrosine Phosphatase Receptor J in Fibroblast to Retard Chronic Kidney Disease Progression
Authors: Bai, Mi and Xu, Shuang and Jiang, Mingzhu and Guo, Yuxian and Hu, Dandan and He, Jia and Wang, Ting and Zhang, Yu and Guo, Yan and Zhang, Yue and others,
Journal: Advanced Science (2024): 2309754
Patterning in stratified epithelia depends on cell--cell adhesion
Authors: Mai, Yosuke and Kobayashi, Yasuaki and Kitahata, Hiroyuki and Seo, Takashi and Nohara, Takuma and Itamoto, Sota and Mai, Shoko and Kumamoto, Junichi and Nagayama, Masaharu and Nishie, Wataru and others,
Journal: Life Science Alliance (2024)
https://www.amyjet.com/products/AAT-23119.shtml
HIS Lite OG488-Tris NTA-Ni复合物：检测细胞、溶液和固体表面中的聚组氨酸标记蛋白
荧光三NTA化合物为聚组氨酸标记蛋白的位点特异性和稳定的非共价荧光标记提供了一种有效的方法。与传统单NTA的瞬时结合相比，三NTA共轭荧光团的多价相互作用与聚组氨酸标记的蛋白质形成了更稳定的复合物。tris-NTA化合物对累积组氨酸的高选择性使其能够选择性标记细胞裂解物和活细胞表面的蛋白质。荧光三NTA偶联物可用于分析溶液和表面上的三元蛋白质复合物。过渡金属离子（如镍离子）介导的聚组氨酸标记蛋白质与荧光tris-NTA偶联物的络合为实时检测和监测蛋白质-蛋白质相互作用提供了灵敏的报告。据报道，这种OG488 tris-NTA化合物是一种灵敏的荧光探针，用于检测细胞、溶液和固体表面中的聚组氨酸标记蛋白。
艾美捷HIS Lite OG488-Tris NTA-Ni复合物：
货号 AAT-12615
单位大小：100微克
目录编号：12615
分子量：1838.08
溶剂：水
校正因子（260纳米）：0.31
校正因子（280纳米）：0.12
消光系数（cm -1 M -1）：76000
激发（纳米）：498
发射（纳米）：526
预期用途：仅供研究使用（RUO）
储存：冷冻（<-15°C）；尽量减少光照
激发：蓝色激光
发射：长路径绿色滤光片（SYBR滤光片）
库存溶液的准备：除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在-20°C。避免反复冻融。
HIS Lite™ OG488-Tris NTA-Ni复合物库存溶液：通过添加适量的去离子水（ddH2O）制备5至10毫摩尔的库存溶液。
注意：将任何未使用的库存溶液储存在-20°C。避免反复冻融，并尽量减少光照。
工作溶液的准备：
HIS Lite™ OG488-Tris NTA-Ni复合物工作溶液
在PBS中制备1至10微米浓度的HIS Lite™ OG488-Tris NTA-Ni复合物工作溶液。
注意：确保有足够的工作溶液完全浸没凝胶。使用后，丢弃工作溶液，不要重复使用。
样品实验协议：
以下协议仅作为指导，并可能需要优化以更好地适应您的具体实验需求。
跑后凝胶染色协议：
根据您的标准协议运行凝胶。
将凝胶放置在合适的容器中。将凝胶固定在固定液中60分钟。注意：40%乙醇+10%醋酸可以作为固定液。
用超纯水两次洗涤凝胶。
将凝胶在HIS Lite™ OG488-Tris NTA-Ni复合物工作溶液中孵育60分钟。
注意：确保凝胶完全浸没在工作溶液中。
移除工作溶液，并用PBS两次洗涤凝胶。
立即进行凝胶成像。
体外复合物形成：
将带有His标签的蛋白溶液与HIS Lite™ OG488-Tris NTA-Ni复合物工作溶液按适当浓度混合。
注意：必须对HIS Lite™ OG488-Tris NTA-Ni复合物与带有His标签的蛋白混合物进行优化，以获得更好的标记。
注意：1至10微米的HIS Lite™ OG488-Tris NTA-Ni复合物可以用作起始浓度。
注意：反应可以在含有50 mM HEPES/KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM β-巯基乙醇，5%甘油的缓冲液中进行，或者在您选择的缓冲液中进行。
混合物可以在室温下孵育30分钟，或在4°C下孵育。
注意：必须对孵育时间和条件进行优化，以获得更好的标记。
然后，混合物可以进行柱纯化或任何其他下游处理。
https://www.amyjet.com/products/AAT-12615.shtml
花青-3- dUTP [Cy 3-dUTP] ：DNA标记与检测的高效工具
染料修饰的脱氧尿苷5'-三磷酸盐（如氨基烯丙基dUTP）可用于通过常规酶掺入方法（如逆转录、缺口翻译、随机引物标记或PCR）生产含染料的DNA。这种酶荧光标记方法广泛用于FISH探针和基于微阵列的实验。这种Cy3-dUTP缀合物可以用Spectrum Orange™滤光片组作为红色荧光色（Spectrum Oranges™是Vysis的商标）。它在功能上与Cyanine 3-dUTP（Perkin-Elmer的NEL578001EA）相当。
货号 AAT-17025
单位大小：25纳摩尔
分子量：1150.00
溶剂：水
预期用途 仅供研究使用（RUO）
储存条件：冷冻（<-15°C）；尽量减少光照
校正因子（260纳米）：0.07
校正因子（280纳米）：0.073
消光系数（cm -1 M -1）：150000
激发（纳米）：555
发射（纳米）：569
量子产率：0.15
图：Cy3和iFluor®555 dUTP标记的端粒探针在中期HeLa细胞中的荧光原位杂交。
花青-3- dUTP [Cy 3-dUTP] 文献参考：
A Fluorescent DNA Hydrogel Aptasensor Based on the Self-Assembly of Rolling Circle Amplification Products for Sensitive Detection of Ochratoxin A.
Authors: Hao, Liling and Wang, Wei and Shen, Xueqing and Wang, Shuliu and Li, Qian and An, Faliang and Wu, Shijia
Journal: Journal of agricultural and food chemistry (2020): 369-375
Engineering nicking enzymes that preferentially nick 5-methylcytosine-modified DNA.
Authors: Gutjahr, Alice and Xu, Shuang-yong
Journal: Nucleic acids research (2014): e77
Digital detection of multiple minority mutants in stool DNA for noninvasive colorectal cancer diagnosis.
Authors: Deng, Lili and Qi, Zongtai and Zou, Binjie and Wu, Haiping and Huang, Huan and Kajiyama, Tomoharu and Kambara, Hideki and Zhou, Guohua
Journal: Analytical chemistry (2012): 5645-52
Digital analysis of the expression levels of multiple colorectal cancer-related genes by multiplexed digital-PCR coupled with hydrogel bead-array.
Authors: Qi, Zongtai and Ma, Yinjiao and Deng, Lili and Wu, Haiping and Zhou, Guohua and Kajiyama, Tomoharu and Kambara, Hideki
Journal: The Analyst (2011): 2252-9
Microisolation and microcloning of bovine X-chromosomes for identification of sorted buffalo (Bubalus bubalis) spermatozoa.
Authors: Zhuang, Xin-jie and Lu, Yang-qing and Zhang, Ming and Lu, Sheng-sheng and Lu, Ke-huan
Journal: Animal reproduction science (2011): 32-6
https://www.amyjet.com/products/AAT-17025.shtml
鬼笔环肽-iFluor 488偶联物，更高分辨率、更详细的染色
Phalloidin偶联物以高亲和力染色固定和渗透细胞中的F-actin。
Phalloidin是一种从毒死帽蘑菇鹅膏菌中分离出来的双环七肽。其对丝状肌动蛋白（F-actin）与单体G-肌动蛋白之间的凹槽的高结合亲和力被广泛用于在组织切片、细胞培养或无细胞制剂中可视化和定量F-actin。与肌动蛋白特异性抗体相比，鬼笔环肽的非特异性结合可以忽略不计，从而在细胞成像过程中提供最小的背景和高对比度。一旦与F-actin结合，鬼笔环肽就会将单体和细丝的平衡向细丝侧移动，并抑制ATP水解。这种相互作用通过防止亚基解离来稳定肌动蛋白丝，并通过降低临界浓度来促进肌动蛋白聚合。
当与荧光染料结合时，鬼笔环肽可以以纳摩尔浓度用于标记和可视化固定和渗透细胞、细胞培养和无细胞实验中的F-actin，以及甲醛固定和渗透组织切片。Phalloidin偶联物对所有类型和大小的肌动蛋白丝表现出相似的亲和力，在肌肉和非肌肉细胞中以1:1的化学计量比（phallotoxin:肌动蛋白）结合。与抗体相比，鬼笔环肽衍生物很小（<2kDa），与鬼笔环蛋白结合的细丝不会阻碍细丝的功能特性。小尺寸也允许更密集的F-actin标记，在更高分辨率下成像时产生更详细的染色。此外，由于肌动蛋白在进化上是保守的，鬼笔环肽衍生物的结合特性可用于染色各种动物和植物细胞。
货号 AAT-23115
偶联物：iFluor 488
单位大小：300次测试
分子量：~1400
溶剂：DMSO
预期用途 仅供研究使用（RUO）
储存：冷冻（<-15°C）；尽量减少光照
校正因子（260纳米）：0.21
校正因子（280纳米）：0.11
消光系数（cm -1 M -1）：75000
激发（纳米）：491
发射（纳米）：516
量子产率：0.9
协议概要：
在微孔板孔中准备样品
从板中的样品中移除液体
加入Phalloidin-iFluor™ 488偶联溶液（每孔100 μL）
在室温下对细胞进行20至90分钟的染色
洗涤细胞
在显微镜下使用FITC滤光片检查样本
重要事项 在打开前将瓶加热至室温并短暂离心。
储存和处理条件：
如果储存在-20°C，溶液至少稳定6个月。保护荧光偶联物不受光线影响，并避免冻融循环。
注意 Phalloidin有毒，尽管一瓶中的毒素量可能只对蚊子致命（Phalloidin的LD50 = 2 mg/kg），应小心处理。
工作溶液的准备：
Phalloidin-iFluor™ 488偶联工作溶液
将1 μL的Phalloidin-iFluor™ 488偶联溶液加入到含1% BSA的PBS中。
注意 Phalloidin偶联物的库存溶液应分装并储存在-20°C，避免光线照射。
注意 不同细胞类型可能染色不同。应相应准备Phalloidin偶联工作溶液的浓度。
样品实验协议：
染色细胞
进行甲醛固定。在室温下，将细胞与PBS中的3.0-4.0%甲醛一起孵育10-30分钟。
注意：避免使用任何含有甲醇的固定剂，因为甲醇可能会在固定过程中破坏肌动蛋白。首选的固定剂是无甲醇的甲醛。
用PBS冲洗固定的细胞2-3次。
可选：将0.1% Triton X-100加入PBS中，用于固定细胞3至5分钟以增加通透性。用PBS冲洗细胞2-3次。
在固定的细胞中加入100 μL/孔（96孔板）的Phalloidin-iFluor™ 488偶联工作溶液，并在室温下对细胞进行20至90分钟的染色。
在将细胞板封盖和在显微镜下使用FITC滤光片组进行成像之前，用PBS轻轻冲洗细胞2至3次以去除多余的Phalloidin偶联物。
图：使用带有FITC滤光片组的荧光显微镜（绿色）对用Phalloidin iFluor®488共轭物染色的HeLa细胞的荧光图像。将细胞固定在4%甲醛中，用线粒体染料MitoLite™Red FX600（Cat#2677，红色）和Nuclear Blue™DCS1（Cat#17548，蓝色）共标记。
https://www.amyjet.com/products/AAT-23115.shtml
iFluor 488-麦胚凝集素(WGA)结合物：明亮、光稳定的iFluor染料标记的偶联物
小麦胚芽凝集素（Wheat Germ Agglutinin, WGA）是一种最初从小麦（Triticum vulgare）中提取的糖类结合凝集素。与其他凝集素，如美洲商陆凝集素A（Concanavalin A, ConA）一样，WGA对细胞表面和细胞内糖结合物（例如，糖蛋白和糖脂）上常见的特定糖残基表现出高亲和力。这种特异性常被用于荧光成像和分析技术中，以标记真核细胞的质膜、革兰氏阳性细菌和酵母芽痕，染色纤维性瘢痕组织，以及在凝胶中定位和检测糖基化蛋白。荧光WGA偶联物，包括那些用明亮、光稳定的iFluor®染料标记的偶联物，为设计共定位和其他多色实验提供了更大的灵活性，用于成像和流式细胞术。
小麦胚芽凝集素的性质
小麦胚芽凝集素选择性地结合到糖结合物和整个细胞表面发现的寡糖上的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和N-乙酰神经氨酸（唾液酸）残基。这些残基的存在和分布不仅在不同细胞和细胞器类型之间有所不同，而且在各种病理状态下可能异常表达，使WGA成为识别和分析这些表型的有用标记。WGA是水溶性的，在溶液中主要以分子量约为38 kDa的异二聚体形式存在。在生理条件下，WGA是阳离子性的（等电点>9），无法穿透活细胞。在用荧光WGA偶联物染色以检测细胞内糖结合物和寡糖之前，必须固定细胞和组织样本。
当WGA用琥珀酸酐琥珀酰化时，其在中性pH下的溶解度增加了100倍，并且可以用最低浓度2 µg/mL使兔子和人类红细胞（A、B和O血型）凝集。像未修饰的WGA一样，琥珀酰化的WGA对GlcNAc残基具有特异性。然而，它失去了对唾液酸残基的结合亲和力，这表明两种凝集素可以作为区分N-乙酰葡萄糖胺化和唾液酸化糖结合物的系统。
荧光WGA偶联物通常用于成像和流式细胞术中，以定位和检测细胞表面或细胞内的糖结合物。它们有助于根据糖蛋白组成识别细胞类型，并且用于标记真核细胞壁、纤维性瘢痕组织、酵母芽痕、甲壳质和细菌细胞壁肽聚糖。后者已用于区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。
货号 AAT-25530
单位大小：1毫克
溶剂：水
校正因子（260纳米）：0.21
校正因子（280纳米）：0.11
消光系数（cm -1 M -1）：75000
激发（纳米）：491
发射（纳米）：516
量子产率：0.9
预期用途 仅供研究使用（RUO）
储存条件：冷冻（<-15°C）；尽量减少光照
荧光iFluor-WGA偶联物：
AAT Bioquest提供多种荧光颜色的iFluor-WGA偶联物，从深蓝色到近红外波长，特别是AAT Bioquest的绿色荧光iFluor 488、红色荧光iFluor 594和远红色荧光iFluor 647-WGA偶联物。这些偶联物与其相应的FITC、Texas Red和Cy5对应物的光谱几乎相同，但在更宽的pH范围（pH 4至10）内提供了明显更亮、更稳定的荧光信号。发射峰值在670 nm的长波长iFluor 647-WGA偶联物，在多色成像或处理已知具有高固有自发荧光的样本（如组织）时提供了显著的优势。iFluor 647的荧光发射与常用的蓝色和绿色荧光染料的发射很好地分离，消除了补偿的需要。
AAT Bioquest还提供几种用AAT Bioquest的Alexa Fluor XFD等效物标记的WGA偶联物，包括广泛使用的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 594染料等。所有XFD染料与Alexa Fluor替代品具有完全相同的化学结构。
库存溶液的准备：
除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在-20°C。避免反复冻融循环。
iFluor 488-小麦胚芽凝集素（WGA）偶联物库存溶液（200X）
将500 µL的去离子水加入粉末中，制成2 mg/mL的库存溶液。
注意：重组的偶联溶液可以储存在2-8°C进行短期储存，或在-20°C进行长期储存。
工作溶液的准备：
iFluor 488-小麦胚芽凝集素（WGA）偶联物工作溶液（1X）
将5 µL的200X WGA偶联溶液加入1 mL的HHBS缓冲液中。
注意：不同细胞系的优化染色浓度可能不同。推荐的起始浓度为活细胞的5-10 µg/mL。
样品实验协议：
在打开前将瓶加热至室温并短暂离心。染色协议因应用而异。应通过实验确定偶联物的适当稀释度。
活细胞染色：
用HHBS缓冲液两次洗涤细胞。
加入100 µL iFluor 488-WGA工作溶液。
在37°C下用WGA工作溶液孵育细胞10-30分钟。
用HHBS缓冲液两次洗涤细胞。
使用FITC滤光片组在荧光显微镜下成像细胞。
固定细胞染色
WGA偶联物也可用于染色固定细胞。
用4%甲醛在PBS中固定细胞。
注意：对于固定细胞膜染色，建议在不渗透的步骤中进行染色。固定后的渗透步骤可以促进染色细胞内室，如高尔基体和内质网（ER）结构。
加入100 µL iFluor 488-WGA工作溶液。
在室温下用WGA工作溶液孵育细胞10-30分钟。
用HHBS缓冲液两次洗涤细胞。
使用FITC滤光片组在荧光显微镜下成像细胞。
图：活HeLa细胞用5µg/mL的iFluor®488小麦胚凝集素（WGA）偶联物染色30分钟，然后用Hoechst 33342（AAT Cat#17535）染色。使用FITC和DAPI滤光片组通过荧光显微镜获取图像。
https://www.amyjet.com/products/AAT-25530.shtml
iFluor 488琥珀酰亚胺酯：稳定性与亮度兼备的标记染料
尽管FITC仍然是准备绿色荧光生物偶联物最受欢迎的荧光标记染料，但FITC存在某些局限性，例如显微镜成像时的严重光漂白和pH敏感的荧光。与FITC等荧光素衍生物相比，使用iFluor® 488染料制备的蛋白质偶联物要优越得多。iFluor® 488偶联物的亮度明显高于荧光素偶联物，并且更加光稳定。此外，iFluor® 488的荧光不受pH（4-10）的影响。这种pH不敏感性是相对于只在pH高于9时才发出最大荧光的荧光素的一个重要改进。iFluor® 488 SE染料相当稳定，并且显示出与蛋白质氨基基团的良好反应性和选择性。这种iFluor® 488的光谱特性和反应性与Alexa Fluor® 488 NHS酯（Alexa Fluor®是Invitrogen的商标）相似。
艾美捷iFluor 488琥珀酰亚胺酯：
货号 AAT-1023
分子量：945.07
溶剂：DMSO
校正因子（260纳米）：0.21
校正因子（280纳米）：0.11
消光系数（cm -1 M -1）：750001
激发（纳米）：491
发射（纳米）：516
量子产率：0.91
预期用途 仅供研究使用（RUO）
储存条件：冷冻（<-15°C）；尽量减少光照
库存溶液的准备：
除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在-20°C。避免反复冻融循环。
蛋白质库存溶液（溶液A）：
将100 µL的反应缓冲液（例如，1 M 碳酸钠溶液或pH约为8.5至9.0的1 M磷酸缓冲液）与900 µL的目标蛋白质溶液（例如，抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL如果可能的话）混合，得到1 mL蛋白质标记库存溶液。
注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH应为8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，请使用1 M 碳酸钠溶液或1 M pH 9.0磷酸缓冲液将pH调整到8.0-9.0的范围。
注意：蛋白质应溶解在1X磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果蛋白质是溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，必须对其进行透析，以对抗1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。
注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体将不会被很好地标记。亚硝酸钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。亚硝酸钠或硫柳汞可以通过透析或旋转柱来去除，以获得最佳的标记结果。
注意：如果蛋白质浓度低于2 mg/mL，偶联效率将显著降低。建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg/mL，以获得最佳的标记效率。
iFluor® 488 SE库存溶液（溶液B）：
将无水DMSO加入iFluor® 488 SE瓶中，制成10 mM库存溶液。通过移液或涡旋混合均匀。
注意：在开始偶联之前准备染料库存溶液（溶液B）。请立即使用。染料库存溶液的长期储存可能会降低染料活性。溶液B可以在避光和防潮的情况下冷冻保存两周。避免冻融循环。
样品实验协议：
这个标记协议是为山羊抗小鼠IgG与iFluor® 488 SE的偶联而开发的。您可能需要为您特定的蛋白质进行进一步优化。
注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。过度标记蛋白质可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比例的蛋白质偶联物则灵敏度降低。
运行偶联反应：
使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比例作为起点：将5 µL的染料库存溶液（溶液B，假设染料库存溶液为10 mM）加入到蛋白质溶液（95 µL的溶液A）中，并有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg/mL，蛋白质的分子量约为200KD，则蛋白质的浓度约为0.05 mM。
注意：我们建议使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比例。如果太低或太高，请分别确定5:1、15:1和20:1的最佳染料/蛋白质比例。
继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
纯化偶联物：
以下是一个使用Sephadex G-25柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例协议。
根据制造商的说明准备Sephadex G-25柱。
将反应混合物（来自“运行偶联反应”）加载到Sephadex G-25柱的顶部。
一旦样品运行到树脂表面顶部以下，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。
向所需的样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成柱纯化。合并包含所需染料-蛋白质偶联物的分数。
注意：如果立即使用，染料-蛋白质偶联物必须用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。
注意：对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
表征所需的染料-蛋白质偶联物：
取代度（DOS）是表征染料标记蛋白质的最重要因素。较低DOS的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高DOS的蛋白质（例如，DOS>6）也倾向于荧光减少。对于大多数抗体，建议的最佳DOS在2到10之间，具体取决于染料和蛋白质的性质。为了有效的标记，应该控制取代度，使每摩尔抗体有6-8摩尔的iFluor® 488 SE。以下步骤用于确定iFluor® 488 SE标记蛋白质的DOS。
测量吸收：
要测量染料-蛋白质偶联物的吸收光谱，建议保持样品浓度在1-10 µM的范围内，具体取决于染料的消光系数。
在280 nm和染料最大吸收（λmax = 490 nm对于iFluor® 488染料）处读取OD（吸光度）
对于大多数分光光度计，需要将样品（来自柱分数）用去离子水稀释，以便O.D.值在0.1到0.9的范围内。280 nm处的O.D.（吸光度）是蛋白质的最大吸收，而490 nm是iFluor® 488 SE的最大吸收。为了获得准确的DOS，确保偶联物中不含未偶联的染料。
图：用iFluor 488抗人CD24*HI45*缀合物染色的PBMC的流式细胞术分析。在iFluor 488特异性B2-A通道中使用Aurora光谱流式细胞仪监测荧光信号。
https://www.amyjet.com/products/AAT-1023.shtml
iFluor 555琥珀酰亚胺酯--荧光更强，光稳定性更高
AAT Bioquest的iFluor染料针对蛋白质标记进行了优化，特别是抗体。这些染料亮度高、光稳定，并且在蛋白质上几乎不发生猝灭。它们可以被荧光仪器的主要激光线很好地激发（例如，350、405、488、555和633纳米）。iFluor 555染料的荧光激发和发射峰值分别约为~557纳米和~570纳米。iFluor 555系列的光谱特性与Cy3（Cy3是GE Healthcare的商标）基本相同。与Cy3探针相比，iFluor 555试剂的荧光更强，光稳定性更高。它们的荧光在pH 3至11范围内不受pH影响。这些光谱特性使得这一新的染料系列成为Cy3的优越替代品。iFluor 555系列已成为Cy3和Alexa Fluor 555标记染料（Cy3和Alexa Fluor是Invitrogen和GE Health Care的商标）的优秀替代品。iFluor 555 SE相当稳定，并显示出与蛋白质氨基基团的良好反应性和选择性。
艾美捷iFluor 555琥珀酰亚胺酯：
货号 AAT-71557
分子量：1125.26
溶剂：DMSO
校正因子（260纳米）：0.23
校正因子（280纳米）：0.14
消光系数（cm -1 M -1）：100000
激发（纳米）：557
发射（纳米）：570
量子产率：0.64
预期用途 仅供研究使用（RUO）
储存条件：冷冻（<-15°C）；尽量减少光照
示例协议：
库存溶液的准备
除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在-20°C。避免反复冻融循环。
蛋白质库存溶液（溶液A）：
将100 µL的反应缓冲液（例如，1 M 碳酸钠溶液或pH约9.0的1 M磷酸缓冲液）与900 µL的目标蛋白质溶液（例如抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL如果可能的话）混合，得到1 mL蛋白质标记库存溶液。
注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH应为8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的pH低于8.0，请使用1 M 碳酸氢钠溶液或1 M pH 9.0磷酸缓冲液将pH调整到8.0-9.0的范围。
注意：蛋白质应溶解在1X磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中，pH 7.2-7.4。如果蛋白质是溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，必须对其进行透析，以对抗1X PBS，pH 7.2-7.4，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（如硫酸铵和醋酸铵）。
注意：不纯的抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体将不会被很好地标记。亚硝酸钠或硫柳汞的存在也可能干扰偶联反应。亚硝酸钠或硫柳汞可以通过透析或旋转柱来去除，以获得最佳的标记结果。
注意：如果蛋白质浓度低于2 mg/mL，偶联效率将显著降低。为了最佳的标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg/mL。
iFluor™ 555 SE库存溶液（溶液B）：
将无水DMSO加入iFluor™ 555 SE瓶中，制成10 mM库存溶液。通过移液或涡旋混合均匀。
注意：在开始偶联之前准备染料库存溶液（溶液B）。请立即使用。染料库存溶液的长期储存可能会降低染料活性。溶液B可以在避光和防潮的情况下冷冻保存两周。避免冻融循环。
样品实验协议：
这个标记协议是为山羊抗小鼠IgG与iFluor™ 555 SE的偶联而开发的。您可能需要为您特定的蛋白质进行进一步优化。
注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的性质。过度标记蛋白质可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比例的蛋白质偶联物则灵敏度降低。
运行偶联反应：
使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比例作为起点：将5 µL的染料库存溶液（溶液B，假设染料库存溶液是10 mM）加入到蛋白质溶液（95 µL的溶液A）中，并有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg/mL且蛋白质的分子量约为200KD，则蛋白质的浓度约为0.05 mM。
注意：我们建议使用10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比例。如果太低或太高，请分别确定5:1、15:1和20:1的最佳染料/蛋白质比例。
继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
纯化偶联物：
以下是一个使用Sephadex G-25柱纯化染料-蛋白质偶联物的示例协议。
根据制造商的说明准备Sephadex G-25柱。
将反应混合物（来自“运行偶联反应”）加载到Sephadex G-25柱的顶部。
一旦样品运行到树脂表面顶部以下，立即加入PBS（pH 7.2-7.4）。
向所需的样品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成柱纯化。合并包含所需染料-蛋白质偶联物的分数。
注意：如果立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。
注意：对于长期储存，染料-蛋白质偶联物溶液需要浓缩或冷冻干燥。
表征所需的染料-蛋白质偶联物
取代度（DOS）是表征染料标记蛋白质的最重要因素。较低DOS的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但较高DOS的蛋白质也倾向于荧光减少。对于大多数抗体，建议的最佳DOS在2到10之间，具体取决于染料和蛋白质的性质。为了有效的标记，应该控制取代度，使每摩尔抗体有5-8摩尔的iFluor™ 555 SE。以下步骤用于确定iFluor™ 555 SE标记蛋白质的DOS。
测量吸收：
要测量染料-蛋白质偶联物的吸收光谱，建议保持样品浓度在1-10 µM的范围内，具体取决于染料的消光系数。
在280 nm和染料最大吸收（λmax = 557 nm对于iFluor™ 555染料）处读取OD（吸光度）
对于大多数分光光度计，需要将样品（来自柱分数）用去离子水稀释，以便OD值在0.1到0.9的范围内。280 nm处的OD（吸光度）是蛋白质的最大吸收，而557 nm是iFluor™ 555 SE的最大吸收。为了获得准确的DOS，确保偶联物中不含未偶联的染料。
图：HeLa细胞分别与小鼠抗微管蛋白、AAT的iFluorTM 555山羊抗小鼠IgG偶联物（红色，右）或与Alexa Fluor555偶联的山羊抗小鼠IgGs（红色，左）一起孵育。细胞核用Hoechst 33342（蓝色，Cat#17530）染色。
https://www.amyjet.com/products/AAT-71557.shtml
