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Chondrex弗氏不完全佐剂，加强免疫，降低完全佐剂的副作用

弗氏佐剂(Freunds Adjuvant)在20世纪40年代由Jules Freund发明，通常被认为是目前动物实验中最常用的免疫佐剂，常用于动物免疫制备抗体。弗氏佐剂可以使抗原持续缓释，同时又能非特异性地增强机体对抗原的特异性免疫应答，增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型。弗氏佐剂在增强免疫效应的同时，也容易在注射部位引起局部肉芽肿、炎症等不良反应。弗氏佐剂分两种，不含结核杆菌的弗氏不完全佐剂和含结核杆菌的弗氏完全佐剂。除了最常用的弗氏佐剂，还有一些其它的佐剂，如微生物佐剂(如分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及细菌脂多糖等)、脂质体佐剂、多聚核苷酸佐剂、无机物佐剂(如明矾及氢化铝等)、药物类佐剂及一些新型佐剂等。

弗氏不完全佐剂主要成分为油剂和乳化剂，和抗原混合后形成油包水乳液，使抗原缓慢释放，刺激高效长期的抗体产生。弗氏完全佐剂是在弗氏不完全佐剂的基础上添加了结核分枝杆菌。弗氏完全佐剂增强免疫反应的能力更强，一般用于初次免疫。弗氏不完全佐剂一般用于初次免疫后的加强免疫，这样可以避免弗氏完全佐剂的副作用，同时有利于产生高效价的抗体。

艾美捷弗氏不完全佐剂：

货号：7002

量：5毫升。

形态：溶液。

乳化：使用电动均质器将等体积的胶原蛋白乳化。建议不要使用注射器-注射器法来制作用于诱导关节炎的胶原-IFA乳液，但可以用来获得抗血清。

存储：在黑暗中4°C保存。

稳定性：有效期为1年。

Chondrex 弗氏不完全佐剂--用作实验动物免疫抗原的辅助剂。这种不完全的弗氏佐剂（IFA）适用于大鼠的胶原诱导性关节炎（CIA），也可用于II型胶原蛋白的加强注射，以增加小鼠中CIA的发生率。

弗氏不完全佐剂文献参考：

Hu Y et al., Down-regulation of hypoxia-inducible factor-1α by RNA interference alleviates the development of collagen-induced arthritis in rats. Mol Ther Nucleic Acids 19:1330-1342, (2020). PMID: 32160704

Huang G et al., Curcumin protects against collagen-induced arthritis via suppression of BAFF production. J Clin Immunol 33(3), 550-7, (2013). PMID: 23184090

Kwak HB et al., Reciprocal cross-talk between RANKL and interferon-γ-inducible protein 10 is responsible for bone erosive experimental arthritis. Arthritis Rheum 58(5), 1332-42, (2008). PMID: 18438854

Lee WS et al., MicroRNA-9 ameliorates destructive arthritis through down-regulation of NF-κB1-RANKL pathway in fibroblast-like synoviocytes. Clin Immunol 212:108348, (2020). PMID: 31978557

Li Y et al., Succinate induces synovial angiogenesis in rheumatoid arthritis through metabolic remodeling and HIF-1α/VEGF axis. Free Radic Biol Med 126:1-14, (2018). PMID: 30030103

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弗氏完全佐剂，1 mg/ml：在免疫学研究中的重要作用

弗氏完全佐剂是一种油包水的乳浊液，能够非常有效的诱导产生高滴度的抗体。弗氏完全佐剂含结核分枝杆菌的细胞壁成分，可以加强对抗原的抗体反应。佐剂活性来自于油滴中免疫原的持续释放，并刺激局部免疫反应。简单的说，这个注射入哺乳动物皮下之后，会产生炎症和疼痛。

弗氏完全佐剂的应用：

通常将抗原（优选在盐水中）与等体积的佐剂混合以形成乳液。

弗氏佐剂可用于制备免疫原的油包水乳液。抗原由于释放缓慢，油包水乳液中的抗原可刺激高效长期的抗体应答。

完全弗氏佐剂中的分枝杆菌柯林斯将巨噬细胞状语从句：其他细胞吸引到注射部位，从而增强免疫应答。鉴于此原因，弗氏将完全佐剂用于初始注射，而将弗氏不完全用于佐剂的随后加强注射。

艾美捷弗氏完全佐剂，1 mg/ml：

货号：7008

应用：用于诱导小鼠的胶原诱导性关节炎（CIA）和大鼠的佐剂诱导性关节炎（AIA）。

规格：5毫升。

形式：1 mg/ml溶液。

乳化：使用电动均质器与等体积的胶原乳化。 不推荐使用注射器-注射器方法制作胶原-CFA乳剂以诱导关节炎，但可用于获取抗血清。

存储：在4°C避光保存。

稳定性：可保存1年。

注释：使用前请充分涡旋，以确保结核分枝杆菌剂量的一致性。

Chondrex 弗氏完全佐剂，1 mg/ml ：热灭活的结核分枝杆菌 H37 RA（非活性）以1 mg/ml的浓度悬浮于不完全的弗氏佐剂中。

弗氏完全佐剂，1 mg/ml相关产品：

7001      Complete Freund's Adjuvant, 4 mg/ml

20021      Immunization Grade Bovine Type II Collagen

20022      Immunization Grade Bovine Type II Collagen, Solution

20011      Immunization Grade Chick Type II Collagen

20012      Immunization Grade Chick Type II Collagen, Solution

7002      Incomplete Freund's Adjuvant

文献参考：

C. William, et al. J. Exp. Med. 162: 1878-1891 (1985)

I. Campbell, et al. Eur. J. Immunol. 30: 1568-1575 (2000)

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II型胶原蛋白检测试剂盒，多物种的灵敏度与特异性分析

II型胶原蛋白在胶原蛋白家族中独特，其组织分布仅限于无血管组织，如软骨和眼球的玻璃体。由于II型胶原蛋白可以在实验动物中诱导关节炎，因此在某些自身免疫性疾病的发病机制中，怀疑存在对II型胶原蛋白的自身免疫反应，这些疾病包括类风湿关节炎（RA）、与RA相关的眼部疾病，以及影响特定含有II型胶原蛋白的组织的复发性多软骨炎。

II型胶原蛋白检测试剂盒（编号：6018）旨在通过ELISA定量来自人类、猴子、猪、牛、鼠类、兔子、马、狗和小鸡等不同物种的可溶性天然II型胶原蛋白，适用于细胞培养样本或组织标本。该试剂盒可选择在1步或2步程序中进行标准和检测抗体步骤（检测大纲）。Chondrex建议使用1步方案以节省时间。然而，2步检测协议与Chondrex I型胶原蛋白检测试剂盒的协议相同，两者的标准曲线和样本结果可比较。请使用最适合您研究的协议。

ELISA检测试剂盒用于定量多种物种的II型胶原蛋白。

艾美捷II型胶原蛋白检测试剂盒，多物种：

货号：6018

格式：96孔ELISA板，带可拆卸条。

检测类型：夹心ELISA。

检测时间：

1步法：3.5小时；

2步法：5.5小时。

标准范围：200 ng/ml - 3.1 ng/ml。

样本数量：每板最多可处理40个（重复）样本。

样本类型：溶解胶原蛋白和细胞培养基。

推荐样本稀释：1:1 - 1:1000。

着色剂：OPD（在490 nm读取）。

存储：-20°C，保存12个月。

验证数据：组内重复（2.1-4.4%）/组间重复（6.3-9.3%）/加标测试（86-97%）。

注释：该试剂盒可选择在1步或2步程序中进行标准和检测抗体步骤的操作。

溶解胶原蛋白：

为通过ELISA测定培养细胞层和组织中的胶原蛋白含量，需要对胶原蛋白进行溶解。对于组织标本，强烈建议使用少量胃蛋白酶进行原胶原的制备，因为其他中性蛋白酶，如胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，会将胶原蛋白消化为小肽。胃蛋白酶只会消化胶原分子N端和C端的肽段，而无法消化胶原分子的螺旋结构区域。

通过有限的胃蛋白酶消化从组织中溶解胶原蛋白（通常胶原蛋白与胃蛋白酶的比例为100:1）取决于组织类型和分子内及分子间交联的含量。例如，骨头和跟腱对胃蛋白酶消化具有抵抗性，只有10-20%的胶原组织会被溶解。小牛皮胶原蛋白在24-48小时内可被胃蛋白酶完全溶解，而成年皮肤的溶解时间则需7-9天。对胃蛋白酶抗性不溶胶原可通过碱性处理溶解。将不溶胶原悬浮在含10% Na2SO4和0.1M胺类化合物（如Tris）的冷0.1N NaOH溶液中，并在4°C下培养1-2周。处理完后用HCl中和pH至5.0，再用0.05M醋酸或中性缓冲液（如0.1M Tris-0.3M NaCl，pH 7.5）稀释。

因此，个体样本的最佳溶解条件应在处理样本之前确定。胶原蛋白可以在非还原条件下通过6% SDS凝胶进行分析，以真实的I型胶原作为标准。如果样本中出现比γ链（分子量=300 Kd）更大的带，样本必须进一步用胃蛋白酶或弹性酶消化，这将消化分子内及分子间的胶原交联。另一方面，如果在α链（分子量=100 Kd）下观察到较小的带或拖尾带，可能是样本过度消化。因此，了解各个胶原样本的生物和物理化学特性至关重要。

计算结果：

对空白（B）、标准和测试样本的重复OD值进行平均。

从标准和测试样本的平均OD值中减去平均的空白OD值。

将标准的OD值与标准浓度（ng/ml）绘图，使用对数/对数图将数据线性化。图1显示了一个代表性实验，其中标准范围为3.1-200 ng/ml，并比较了1步和2步协议。

测试样本中胶原蛋白的ng/ml可以通过回归分析计算。将其乘以样本稀释因子，以获得原始样本标本中的胶原蛋白浓度（ng/ml）。

图1 - II型胶原蛋白检测ELISA试剂盒的典型标准曲线

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天狼猩红胶原蛋白染色试剂盒计算方法及文献参考

天狼星红和快绿是一种用于区分胶原蛋白与其周围物质的染料组合。天狼星红专门绑定[Gly-X-Y]原纤维胶原的螺旋结构，无论胶原类型或种类如何，而Fast Green与非胶原结合蛋白质。通过利用这两种染料的独特特征，Chondrex 提供了一种简单的半定量测定试剂盒来测定培养细胞层和组织切片中胶原蛋白和非胶原蛋白的量（1-2）。因为该测定不需要胶原蛋白增溶，可用于测量各种组织中的总胶原蛋白含量（3-7）。由于天狼星红和快绿分别在540 nm和605 nm处有吸收，因此提取的染料的OD值可用于计算样品的胶原蛋白和非胶原蛋白含量。用于组织切片为10-20的一般组织学研究μm厚，胶原蛋白和非胶原蛋白的检测灵敏度分别大于3μg/切片和50μg/切片。这个试剂盒中的试剂足以对30-50个样本进行染色。

艾美捷天狼猩红胶原蛋白染色试剂盒：

货号：9046

描述：总胶原蛋白定量染色试剂盒

格式： 玻璃载玻片和细胞培养板

检测类型： 染料染色

检测时间： 根据样本类型不同而有所变化

标准范围： 胶原蛋白：每个切片3微克

非胶原蛋白质：每个切片50微克

样本数量： 每个试剂盒可处理30-50个样本

样本类型： 培养细胞和组织切片

推荐样本稀释倍数： 不适用

显色剂： 不适用（在540和605纳米处读取）

存储： 室温下可保存12个月

天狼猩红胶原蛋白染色试剂盒试剂盒内容：

项目 数量 金额 存储条件

染料溶液（90461） 1瓶 10毫升 室温

染料提取缓冲液（90462） 2瓶 30毫升 室温

计算结果：

要计算胶原蛋白的量，需要通过减去Fast Green在540 nm的贡献来校正OD 540值，Fast Green在OD 605值中占29.1%。在OD 540和605下，胶原蛋白的颜色等效（OD值/μg蛋白）为0.0378，非胶原蛋白的为0.00204。

胶原蛋白（μg/节）=【OD 540 value – (OD 605 value x 0.291)】/0.0378

非胶原蛋白（μg/节）=OD 605 value/0.00204

注意事项1：较厚的切片在洗涤步骤中容易从载玻片上脱落，请仔细洗涤载玻片。此外，由于检测灵敏度与载玻片上组织的表面积有关，切割较薄的切片不会显著提高检测灵敏度。

注意事项2：非胶原蛋白值可用于标准化样本结果，因为蛋白质水平与样本的表面积或细胞密度相关。

天狼猩红胶原蛋白染色试剂盒文献参考：

1. M. Marotta, G. Martino, Sensitive Spectrophotometric Method for the Quantitative Estimation of Collagen. Anal Biochem 150, 86-90 (1985).

2. L. López-De Leon, M. Rojkind, A Simple Micromethod for Collagen and Total Protein Determination in Formalin-Fixed ParaffinEmbedded Sections. J Histochem Cytochem 33, 737-43 (1985).

3. W. Jimenez, A. Parés, J. Caballería, D. Heredia, M. Bruguera, et al., Measurement of Fibrosis in Needle Liver Biopsies: Evaluation of a Colorimetric Method. Hepatology 5, 815-8 (Sep-).

4. B. Yue, J. Sugar, K. Schrode, Collagen Staining in Corneal Tissues. Curr Eye Res 5, 559-64 (1986).

5. P. Bedossa, G. Lemaigre, J. Bacci, E. Martin, Quantitative Estimation of the Collagen Content in Normal and Pathologic Pancreas Tissue. Digestion 44, 7-13 (1989).

6. J. James, K. Bosch, D. Aronson, J. Houtkooper, Sirius Red Histophotometry and Spectrophotometry of Sections in the Assessment of the Collagen Content of Liver Tissue and Its Application in Growing Rat Liver. Liver 10, 1-5 (1990).

7. J. Armendáriz-Borunda, M. Rojkind, A Simple Quantitative Method for Collagen Typing in Tissue Samples: Its Application to Human Liver With Schistosomiasis. Coll Relat Res 4, 35-47 (1984).

8. H. E. Thu, I. N. Mohamed, Z. Hussain, N. Mohamed, A. N. Shuid, Eurycoma Longifolia, a Malaysian Medicinal Herb, Significantly Upregulates Proliferation and Differentiation in Pre-Osteoblasts. Int. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2016).

9. J. Hyllested, K. Veje, K. Ostergaard, Histochemical studies of the extracellular matrix of human articular cartilage--a review.Osteoarthritis Cartilage 10, 333-43 (2002).

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天狼星红总胶原检测试剂盒，快速30分钟检测

Sirius红是一种独特的染料，能特异性结合到纤维状胶原蛋白（I型至V型）的Gly-X-Y 螺旋结构上，并且不会区分胶原蛋白的种类和类型。Chondrex, Inc.提供Sirius红总胶原蛋白检测试剂盒，用于检测各种含胶原蛋白样本中的总胶原蛋白含量，如组织标本、细胞培养基和培养细胞。总检测时间不到30分钟，可以对40个样本进行重复测量。由于细胞培养基中胶原蛋白含量较低，可能需要额外的浓缩步骤。为了测定来自不同物种或不同类型样本的胶原蛋白水平，Chondrex, Inc.推荐使用我们的I型胶原蛋白检测ELISA试剂盒和II型胶原蛋白检测ELISA试剂盒。为方便起见，Collagen Detection ELISA试剂盒和Sirius红总胶原蛋白检测试剂盒可以使用相同的样本制备。

艾美捷天狼星红总胶原检测试剂盒：

货号：9062

描述：用于定量样本中总胶原蛋白含量的检测试剂盒

格式：带可拆卸条的96孔ELISA板

检测类型：比色法检测

检测时间：30分钟

标准范围：500 µg/ml至8 µg/ml

样本数量：每板可处理最多40个（重复）样本

样本类型：组织匀浆、细胞培养基和培养细胞

推荐样本稀释：根据样本类型而异

色素：不适用（在510-550 nm下读取）

储存条件：-20°C保存12个月

天狼猩红胶原蛋白染色试剂盒试剂盒内容：

项目 数量 金额 存储条件

标准 - 牛源I型胶原蛋白（90621） 1小瓶 0.5毫克/毫升，1毫升 -20°C

Sirius Red溶液（90622） 1瓶 50毫升 -20°C

洗涤溶液（90623） 1瓶 50毫升 -20°C/*

提取溶液（90624） 1瓶 30毫升 -20°C/*

0.5M醋酸（10倍醋酸）（90625） 1瓶 20毫升 -20°C/*

96孔板（9026） 1个 8孔条 x 12 -20°C/*

*洗涤液、提取液、0.5M醋酸和板也可以在室温下储存。不包括用于细胞培养基样品的浓缩溶液（目录号90626）。

培养基：

含有较高浓度血清的样本可能会导致高背景值。因此，Chondrex公司建议将细胞培养基中的血清补充浓度降低至5%，使用PBS稀释。

样本浓缩：

培养基中胶原蛋白的浓度通常较低，因此在该试剂盒的标准范围内检测培养基样本中的胶原蛋白是困难的。Chondrex公司推荐使用我们的浓缩溶液（产品编号90626）进行样本浓缩。此外，应使用培养基作为阴性对照，因为这种浓缩方法可能会导致背景水平升高。

1. 取1毫升培养基。

2. 添加250微升浓缩溶液。

3. 震荡混匀，并在4°C下孵育16-24小时。

4. 以10,000转/分钟的速度离心3分钟。

5. 丢弃上清液。

6. 添加100微升0.05M醋酸溶液以溶解沉淀。将此溶液作为样本使用。

7. 计算的胶原蛋白浓度应乘以0.1的稀释因子。

化验大纲：

天狼星红总胶原检测试剂盒文献参考：

Chothani S et al., Widespread Translational Control of Fibrosis in the Human Heart by RNA-Binding Proteins. Circulation 140(11):937-951, (2019). PMID: 31284728

Widjaja AA et al., IL-11 neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liver inflammation and fibrosis in NASH. Gastroenterology 157 (3), 777–792.e714, (2019). PMID: 31078624

Schafer S et al., IL-11 is a crucial determinant of cardiovascular fibrosis. Nature 552, 110-115, (2017). PMID: 29160304

Schanaider A et al., Exogenous pulmonary surfactant prevents the development of intra-abdominal adhesions in rats. J Cell Mol Med 20, 632-43 (2016).

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Hypoxyprobe低氧探针F6试剂盒检测说明

使用Hypoxyprobe™-F6试剂盒通过免疫化学检测（包括免疫过氧化物酶法、免疫荧光法或流式细胞术）测量组织和细胞中的缺氧。（Kleiter等，国际放射肿瘤生物物理杂志64

: 592-602，2006；Ljungkvist等，国际放射肿瘤生物物理杂志62: 1157-1168，2005）

Hypoxyprobe低氧探针F6试剂盒检测说明：

在啮齿动物中，标记物的研究始于将CCI-103F溶解在10% DMSO/90%花生油中的腹腔注射，剂量为60 mg/kg（见Ljungkvist等，国际放射肿瘤生物学物理学杂志62

：1157-1168，2005）。注射后60至120分钟，采集感兴趣的组织。对于CCI-103F，60 mg/kg的剂量在摩尔基础上低于Hypoxyprobe, Inc提供的另一个缺氧标记物pimonidazole HCl，但CCI-103F的血浆半衰期更长（t1/2 = 90分钟，相比之下pimonidazole在小鼠中的半衰期为25分钟）。

注射后，Hypoxyprobe™标记物分布到所有组织，但仅在氧浓度低于14微摩尔（相当于37°C时的分压pO2 = 10 mmHg）的细胞中与含硫蛋白、肽和氨基酸形成加合物。正常组织如肝脏、肾脏和皮肤中的细胞在pO2达到或低于10 mmHg，这些组织会与Hypoxyprobe™标记物结合。在采集时，未结合的Hypoxyprobe™标记物会在组织缺氧时被激活并结合。然而，与典型实验中组织暴露的标记物量相比，残留的Hypoxyprobe™标记物浓度非常小，因此在组织采集时的非特异性结合是不可检测的。除了动物研究，Hypoxyprobe™试剂盒也可用于组织培养中的细胞。

图示：CCI-103F结合（右侧面板F6）与pimonidazole结合（左侧面板Pimo）在福尔马林固定、石蜡包埋的犬肿瘤活检的相邻组织切片中的比较。免疫过氧化物酶数据显示，F6结合与pimonidazole的结合非常相似。F6和pimonidazole加合物的兔抗血清无交叉反应，这允许独立测量这两个标记物的结合（见Kleiter等，国际放射肿瘤生物学物理学杂志64

：592-602，2006）。

建议的免疫过氧化物酶分析CCI-103F结合在福尔马林固定的石蜡包埋组织中的协议。Kleiter等，国际放射肿瘤生物学物理学杂志64：592-602，2006。

Hypoxyprobe™技术稳健，鼓励研究者进行自主修改。

艾美捷Hypoxyprobe-低氧探针F6试剂盒：

货号：HP4-XXX

规格：

a. Hypoxyprobe™-F6试剂盒分别含有100、200或1000毫克的CCI-103F（Hypoxyprobe™–F6）。在小动物研究中，典型剂量为每公斤体重60毫克。

b. 每个试剂盒含有稀释的抗CCI-103F兔抗血清（PAbF6），其中含有0.09%的叠氮钠和1%的牛血清白蛋白作为稳定剂。100和200毫克的试剂盒各含有一个200微升单位的抗血清；1000毫克的试剂盒含有两个200微升单位的抗血清。抗血清的最佳操作稀释度需由研究人员确定，但1/200 - 1/500的稀释度在与过氧化物酶标记的山羊抗兔二级抗体结合时能提供强烈的免疫过氧化物酶染色。

不提供： 抗兔二级试剂或其他免疫组化试剂（缓冲液、抗原修复剂等）。

存储：

a. 将Hypoxyprobe™–F6在暗处于室温下保存（也可存放在2-8摄氏度）。

b. 将兔抗血清（PAbF6）存放在2-8摄氏度。

Hypoxyprobe™-F6试剂盒成分的详细描述：

Hypoxyprobe™-F6（CCI-103F）是一种六氟化的2-硝基咪唑，具有六个磁等效的氟原子，分子量为337.2，水溶解度为5.3毫摩尔，相当于1.8 mg/ml。CCI-103F通常通过10% DMSO/花生油混合物进行腹腔给药（Ljungkvist等，国际放射肿瘤学、生物学与物理学杂志62

: 1157-1168，2005年）。CCI-103F在弱光下储存时非常稳定。CCI-103F在缺氧细胞中被还原激活，激活的中间体与蛋白质、肽和氨基酸中的硫醇（巯基）形成稳定的共价加合物。抗CCI-103F的主要抗血清与这些加合物结合，从而可以通过免疫化学方法进行检测。

抗CCI-103F兔抗血清（PAbF6）与还原激活的CCI-103F的蛋白质加合物结合，并以稀释的兔抗血清形式提供，含有0.09%的叠氮钠和1%的BSA作为稳定剂。感兴趣的组织可以通过在福尔马林固定的石蜡包埋切片或冷冻固定切片上进行免疫组织化学分析，或通过流式细胞术和组织解离后分析，或通过西方印迹法进行研究。抗CCI-103F抗血清与CCI-103F的蛋白质、肽和氨基酸加合物结合，但在为免疫组织化学检测准备的组织处理过程中，肽和氨基酸加合物会被洗去，因此免疫组织化学检测仅依赖于缺氧组织中CCI-103F的蛋白质加合物。对福尔马林固定、石蜡包埋组织切片进行免疫过氧化物酶分析时，将组织切片与约1:500稀释的抗CCI-103F抗血清的100微升孵育。然后施加显色的二抗山羊抗兔二抗，以揭示缺氧标记物加合物的分布。

Hypoxyprobe 致力于为氧代谢紊乱引起的恶性和正常组织疾病提供诊断和治疗工具。

艾美捷科技是Hypoxyprobe的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

https://www.amyjet.com/brand/Hypoxyprobe.shtml

Hypoxyprobe低氧探针Gemini试剂盒实验研究及文献参考

使用Hypoxyprobe Gemini试剂盒通过免疫化学检测（包括免疫过氧化物酶法、免疫荧光法或流式细胞术）跟踪单一组织样本中的缺氧变化。Kleiter等人使用免疫过氧化物酶分析对连续切片进行研究（Kleiter et al., Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 64: 592-602, 2006），而Ljungkvist等人则在同一组织切片上使用双重缺氧标记的免疫荧光分析（Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 62: 1157-1168, 2005）。

Hypoxyprobe低氧探针Gemini试剂盒检测说明：

双标记研究在啮齿动物中开始时，通过静脉输注或腹腔注射含有60毫克/公斤体重（约1.5毫克/只小鼠）盐酸匹莫苯溶液。盐酸匹莫苯在生理盐水中的溶解度为116毫克/毫升，因此可以使用非常小的体积。15至90分钟后，施加改变缺氧程度的干预。随后，腹腔注射溶解于10% DMSO/90%花生油中的CCI-103F（见Ljungkvist等，国际放射肿瘤生物物理杂志62: 1157-1168，2005），剂量为60毫克/公斤。注射后60至120分钟，收集目标组织。CCI-103F的60毫克/公斤剂量在摩尔基数上低于盐酸匹莫苯，但CCI-103F的血浆半衰期较长（t1/2 = 90分钟，盐酸匹莫苯在小鼠中的半衰期为25分钟），从而进行补偿。

注射后，Hypoxyprobe™标记物分布到所有组织，但仅在氧浓度低于14微摩尔的细胞中与含硫蛋白、肽和氨基酸形成加合物——相当于37°C下的分压pO2为10 mm Hg。正常组织如肝脏、肾脏和皮肤中的细胞氧分压在10 mm Hg或更低，这些组织会与Hypoxyprobe™标记物结合。在采样时未结合的Hypoxyprobe™标记物在组织中存在时，会在组织解剖时激活并结合，因为解剖后的组织会缺氧。然而，与组织在典型实验中暴露于的Hypoxyprobe™标记物量相比，残留的Hypoxyprobe™标记物浓度非常小，因此在组织采样时任何来自残留Hypoxyprobe™标记物的非特异性结合都是不可检测的。

图示：Gemini试剂盒用于比较口服给药的吡莫达唑（Pimo，左侧面板）和静脉给药的CCI-103F（F6，右侧面板），在来自肿瘤犬的单个肿瘤活检的相邻组织切片中进行分析。Gemini试剂盒中非交叉反应的兔抗血清可独立评估这两种标记物的结合（Kleiter等，国际放射肿瘤生物物理杂志64: 592-602，2006）。

建议的协议： 使用双重缺氧标记物对来自福尔马林固定石蜡包埋组织的相邻切片进行免疫过氧化物酶分析。Kleiter等，国际放射肿瘤生物物理杂志64: 592-602，2006。

艾美捷Hypoxyprobe-低氧探针Gemini试剂盒：

货号：HP5-XXX

规格：

a. Hypoxyprobe™ Gemini试剂盒分别包含100、200或1000毫克的缺氧标记物Hypoxyprobe™-1（哌莫尼达唑HCl）和Hypoxyprobe™-6（CCI103F）。通常在小动物研究中使用每个标记物60毫克/千克体重的剂量。

b. 每个试剂盒包含稀释的亲和纯化抗哌莫尼达唑和稀释的抗CCI103F非交叉反应兔抗血清（PAb2627和PAbF6），其中含有0.09%氙化钠和1%BSA作为稳定剂。100和200毫克的试剂盒各包含一个200微升的抗血清单位；1000毫克的试剂盒包含两个200微升的抗血清单位。抗血清的最佳操作稀释度需由研究人员确定，但1/500-1/1000的稀释度在与过氧化物酶偶联的山羊抗兔次级抗体结合时能提供强的免疫过氧化物酶染色。1/50-1/200的较低稀释度可能更适合双重标记的免疫荧光研究（Ljungkvist et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 62

: 1157-1168, 2005）。

未提供：抗兔次级试剂或其他免疫组织化学试剂（缓冲液、抗原修复剂等）。

储存：

a. 将Hypoxyprobe™-1和Hypoxyprobe™-F6在室温下避光存放（也可存放在2-8摄氏度）。

b. 将兔抗血清（PAb2627和PAbF6）存放在2-8摄氏度。

Hypoxyprobe™-F6试剂盒成分的详细描述：

1) Hypoxyprobe™-1（吡莫尼达唑盐酸盐）和Hypoxyprobe™-F6（CCI-103F）是取代的2-硝基咪唑类化合物。吡莫尼达唑盐酸盐的分子量为290.8，水溶性高达400毫摩尔，等于116毫克/毫升。CCI-103F是一种六氟化的2-硝基咪唑，具有六个磁性等效的氟原子，分子量为337.2，水溶性为5.3毫摩尔，等于1.8毫克/毫升。CCI-103F通常以10% DMSO/花生油混合物通过腹腔注射给药（Ljungkvist等，国际放射肿瘤生物物理杂志62: 1157-1168，2005）。吡莫尼达唑和CCI-103F在缺氧细胞中被还原激活，激活的中间体与蛋白质、肽和氨基酸中的巯基（硫醇）基团形成稳定的共价加合物。抗吡莫尼达唑和抗CCI-103F的初级抗血清以非交叉反应的方式结合这些加合物，从而允许通过免疫化学方法进行检测。

2) 非交叉反应的兔抗血清，能够结合还原激活的吡莫尼达唑（PAb2627）和CCI-103F（PAbF6）的蛋白加合物，作为稀释抗血清供应，含有0.09%的叠氮钠和1%的牛血清白蛋白作为稳定剂。感兴趣的组织可以通过免疫组化技术研究福尔马林固定的石蜡包埋切片或冷冻切片，或者在组织解离后通过流式细胞术，或通过西方印迹法进行研究。抗血清能够结合缺氧细胞中吡莫尼达唑或CCI-103F的蛋白、肽和氨基酸加合物，但免疫组化检测的组织处理会洗掉肽和氨基酸加合物，因此免疫组化检测仅依赖于缺氧组织中吡莫尼达唑或CCI-103F的蛋白加合物。对连续的福尔马林固定、石蜡包埋组织切片进行免疫过氧化物酶分析时，需将组织切片与约1:500稀释的抗吡莫尼达唑或抗CCI-103F抗血清混合孵育100微升。然后应用一种显色的山羊抗兔二级抗体，以揭示缺氧标记加合物的分布。以下提供详细的免疫过氧化物酶协议作为一般指南，但强调Hypoxyprobe™技术稳健，鼓励研究人员自行进行修改。有关冷冻切片研究，请参见Ljungkvist等，国际放射肿瘤生物物理杂志62: 1157-1168，2005及相关参考文献。

Hypoxyprobe 致力于为氧代谢紊乱引起的恶性和正常组织疾病提供诊断和治疗工具。

艾美捷科技是Hypoxyprobe的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

https://www.amyjet.com/brand/Hypoxyprobe.shtml

Chondrex花生粗提取物（CPE）实验方案

由落花生（Arachis hypogaea）制成的粗提落花生提取物（CPE）在相对于其他食物过敏原方面具有最高的过敏性。已鉴定出11种潜在重要的落花生过敏原。其中，Ara h1、Ara h2、Ara h3和Ara h6被指定为主要落花生过敏原。粗提落花生提取物通常用作生化检测（如西方印迹法和酶联免疫吸附试验，ELISA）的参考蛋白，也是动物过敏模型（如I型超敏反应）中公认的过敏原。

图1. 在非还原条件下进行的12% SDS-PAGE。

艾美捷Chondrex花生粗提取物（CPE）（#20041）：

应用： 可用于ELISA和西方印迹法，也可以作为过敏原研究实验动物中的过敏性疾病或进行体外实验。

数量： 10毫克

溶解度： 在pH 8.0缓冲液中为10毫克/毫升

形态： 冻干粉末

来源： 生花生粉（西班牙花生）

存储： 存放于-20°C。重溶后请勿将产品长时间放置在4°C或室温下。

稳定性： 1年

Chondrex-花生粗提取物（CPE）实验方案：

A. 重要提示：处理IgE抗体溶液

IgE抗体在极低浓度下具有生物活性，因此在处理和稀释IgE抗体时需格外小心。通常，几微克的蛋白质可以通过非特异性疏水性结合吸附到1平方厘米的玻璃或塑料表面。因此，如果将1毫升20 µg/ml的IgE抗体溶液（不含阻断剂，如PBS）存放在微量离心管中，几乎所有的IgE抗体都会被吸附到管壁上，溶液中将不会残留可检测的IgE抗体。请勿将IgE溶液稀释至低于100 µg/ml，因为PBS不含阻断剂。可以向PBS中添加适当的阻断剂，例如小鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白（BSA）或其他合适的蛋白质。Chondrex, Inc.提供IgE稀释缓冲液（产品编号3009）用于体外和体内实验中IgE抗体的稀释。

B. 体外脱颗粒肥大细胞的检测

1. 培养肥大细胞，如大鼠嗜碱性白血病细胞（RBL-2H3），直到静止期。将细胞以1 x 10^6个细胞/ml的浓度重悬于含15%胎牛血清（FCS）的Eagle最小必需培养基中，并将细胞悬液转移到96孔（200 µl: 2 x 10^5细胞/孔）或24孔（1 ml: 1 x 10^6细胞/孔）的平底细胞培养板中，在37°C下继续培养至少3小时或过夜。

2. 向孔中添加用含阻断剂的PBS或含FCS的培养基稀释的IgE单克隆抗体（最终浓度：培养基中0-10 µg/ml的IgE抗体），并孵育24小时。  

注意：IgE抗体可以在细胞培养开始时添加到培养基中，而不是在过夜培养后再添加。在这种情况下，FcεRI的表达可能会显著上调。已有报道指出，在RBL-2H3细胞中，FcεRI的表达在24-48小时内会上调2倍，在骨髓来源的肥大细胞中可上调至32倍。

3. 用PBS洗涤IgE致敏细胞3次。

4. 向96孔板添加200 µl（或24孔板添加400 µl）用Tyrode缓冲液稀释的CPE溶液（150 mmol/l NaCl, 2.5 mmol/l KCl, 12 mmol/l NaHCO3, 2 mmol/l MgCl2, 2 mmol/l CaCl2, 1 mg/ml BSA, 1 mg/ml葡萄糖，pH 7.4），在37°C培养1小时（CPE的最终浓度为2 µg/ml）。

5. 向阴性对照孔中添加200 µl（在96孔板中）或400 µl（在24孔板中）溶解在Tyrode缓冲液中的阴性对照抗原，例如BSA（2 µg/ml），以确定β-氨基己糖酶的自发释放。

6. 向100%对照孔中添加200 µl（在96孔板中）或400 µl（在24孔板中）的1% Triton X-100溶于Tyrode溶液中，以确定β-氨基己糖酶的总释放。

7. 使用p-硝基苯基-N-乙酰β-D-葡萄糖胺作为底物检测培养上清液中的β-氨基己糖酶活性。

Chondrex-花生粗提取物（CPE）文献参考：

1. S. Kubo, K. Matsuoka, C. Taya, F. Kitamura, T. Takai, H. Yonekawa, H. Karasuyama, Drastic up-regulation of FceRI on mast cells is

induced by IgE binding through stabilization and accumulation of FceRI on the cell surfaces. J Immunol 167, 3427-34 (2001).

2. L. McKinley, J. Kim, G. Bolgos, J. Siddiqui, D. Remick, Reproducibility of a Novel Model of Murine Asthma-Like Pulmonary Inflammation.

Clin Exp Immunol 136, 224-31 (2004).

3. J. Kim, A. Merry, J. Nemzek, G. Bolgos, J. Siddiqui, D. Remick, et al., Eotaxin Represents the Principal Eosinophil Chemoattractant in

a Novel Murine Asthma Model Induced by House Dust Containing Cockroach Allergens. J Immunol 167, 2808-15 (2001).

Chondrex 致力于开发和生产高纯度胶原蛋白、抗胶原蛋白单克隆抗体和多种ELISA试剂盒等产品，为研究人员提供研究类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis ,RA)发病机制和筛选潜在治疗方法所需的工具。艾美捷科技是Chondrex的中国代理商，为科研工作者提供优质的产品与服务。

https://www.amyjet.com/news/Chondrex-new.shtml