来宝网 2021/10/15点击1853次
据今年3月份发布在ResearchSquare的一项研究，佛罗里达的科学家使用CUT&RUN技术，建立了眼球晶状体中HIF1α结合位点的全基因组图。
我们知道，基因表达可以通过许多不同的机制进行调节，包括转录因子、组蛋白和其他DNA结合蛋白。绘制出DNA和蛋白质之间的相互作用图谱，对于理解基因激活或抑制以及其他细胞过程至关重要。
传统上，可以通过进行染色质免疫沉淀和测序(ChIP-seq)来分析这些相互作用。但是这种方法需要大量的起始材料才能产生足够强的信号以消除背景噪声，并且经常返回假阳性信号。同时，ChIP-seq还需要优化的超声处理来破碎染色质，这可能非常耗时并可能导致样品损失。
在最近的一项研究中，佛罗里达大西洋大学和国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的科学家们利用CUT&RUN技术建立了一个功能性全基因组图谱，该图谱是一种称为缺氧诱导因子的蛋白质复合物的特异性结合位点—HIF1α，位于人眼的晶状体中。该团队表示选择CUT&RUN而不是ChIP-seq分析，是因为前者不需要DNA-蛋白质交联。此外，与ChIP-seq相比，前者成功实验所需的细胞计数极低。
正常而言，随着出生后眼睛的发育，提供健康血液供应的血管随着时间的推移开始萎缩。结果，眼睛中的氧气含量稳步下降，造成缺氧环境。HIF1α作为一种蛋白质复合物，可调节身体对缺氧环境的反应，这意味着它可以在晶状体细胞发育和体内平衡中发挥作用。
研究人员首先选择培养10天左右的大的WhiteLeghorn鸡胚胎中分离出晶状体细胞。收获的细胞用称为DMOG的HIF1α激活剂处理4小时，并用ConA包被的磁珠固定细胞核。之后，样品被分为两组：一组用HIF1α抗体处理，另一组用IgG抗体处理。将pA/MNase添加到样品中以启动碎裂。这种融合蛋白在与感兴趣的蛋白质相互作用的特定区域剪切DNA——在这种情况下，该蛋白质是HIF1α。通过向样品中加入CaCL2溶液来激活MNase，将DNA片段释放到上清液中。CUT&RUN片段用蛋白酶K处理1小时，然后分离DNA进行测序。
在HIF1α激活后，CUT&RUN在原代晶状体细胞中鉴定了8000多种HIF1α-DNA特异性复合物。他们能够使用ATAC-seq和RNA-seq验证并完成结合位点的映射，这表明这些复合物中约有1200个紧密聚集在染色质可及区域。进一步的分析揭示了526个基因的激活或抑制，其中116个基因在转录起始位点10kB内显示HIF1α结合位点。
该实验中收集的数据有助于建立眼晶状体中HIF1αDNA复合物的第一个功能图，同时也强调了健康晶状体发育对HIF1α的需求。最终，CUT&RUN技术的这种成功应用，有助于接下来的大量研究，重点是了解某些蛋白质可能对基因表达的作用。
艾美捷作为表观遗传领域专业的解决方案供应商，推荐EpiGentek的EpiNext CUT&RUN Fast Kit，cat#：P-2028,该试剂盒从低输入提供无超声破碎，以可靠地识别真正的目标蛋白质富集区域并实现高分辨率定位。可满足您快速富集蛋白质结合的DNA并绘制全基因组蛋白质/DNA相互作用的图谱的需求。
结果展示：
来源：https://www.amyjet.com/featured/cutrun-2.shtml
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CUT&RUN技术新发现丨EpiNext CUT&RUN Fast Kit
CUT&RUN实验可以用来分析多种蛋白的染色质图谱，包括PTMs，转录因子，染色质remodelers和染色质writers/readers。
如果你对这个技术不是很熟悉，建议你从细胞类型、实验条件、对照、抗体等方面来入手。这个试剂盒它可以兼顾多种细胞类型。
对于未固定的细胞，是研究组蛋白PTMs和转录因子理想的实验材料。这种细胞可以有多种来源，包括贴壁、悬浮细胞，组织样品。
CUT&RUN也可以用lightly-crosslinked细胞，样品固定一般用于研究一些染色质瞬时作用因子和某些PTMs。也可以提取nuclei，这种方法用于研究那些量很少的PTMs和蛋白。另外，当你的实验材料是免疫细胞时，也推荐提取nuclei，因为ConA beads可以激活某些免疫细胞。
对照和标准化是整个实验的关键步骤。阳性对照推荐使用H3K4me3或者H3K27me3,；阴性对照推荐使用Rabbit IgG。你还可以使用spike-in来进行标准化。
在最近的一项研究中，佛罗里达大西洋大学和国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的科学家们利用CUT&RUN技术建立了一个功能性全基因组图谱，该图谱是一种称为缺氧诱导因子的蛋白质复合物的特异性结合位点—HIF1α，位于人眼的晶状体中。该团队表示选择CUT&RUN而不是ChIP-seq分析，是因为前者不需要DNA-蛋白质交联。此外，与ChIP-seq相比，前者成功实验所需的细胞计数极低。
正常而言，随着出生后眼睛的发育，提供健康血液供应的血管随着时间的推移开始萎缩。结果，眼睛中的氧气含量稳步下降，造成缺氧环境。HIF1α作为一种蛋白质复合物，可调节身体对缺氧环境的反应，这意味着它可以在晶状体细胞发育和体内平衡中发挥作用。
该实验中收集的数据有助于建立眼晶状体中HIF1αDNA复合物的第一个功能图，同时也强调了健康晶状体发育对HIF1α的需求。最终，CUT&RUN技术的这种成功应用，有助于接下来的大量研究，重点是了解某些蛋白质可能对基因表达的作用。
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来源：https://www.amyjet.com/featured/cutrun-2.shtml
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CUT&RUN常见问题解析
CUT&RUN全称Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease，是一种新型技术方法。有关CUT&RUN的常见的3个问题整理如下：
1、如何验证一抗在CUT&RUN中起作用？
对于CUT＆RUN实验，验证数据可以包括例如 Tapestation或Bionalyzer图显示大小分布，qPCR数据显示靶标富集。由于CUT&RUN的样本量较低，获得的DNA也相对较少，对于低丰度的靶蛋白，浓度通常太低而无法使用荧光测定法或毛细管电泳测量，所以需要选择高灵敏度的Qubit 或 Nanodrop fluorometer以及Tapestation或Bionalyzer。如果获得的DNA＜50bp ，PCR扩增是无法进行的。一旦产生了测序文库并进行了测序图测序，就可以读取并验证读取在已知结合位点的积累。
2、实验中是否需要使用二抗？
二抗的使用取决于抗体和pA/G-MNase融合蛋白的宿主和亚型，对于pA / G-MNase结合，可能是需要的。蛋白A对所有兔IgG抗体具有良好的高亲和力，但对大鼠，山羊和绵羊IgG同种型抗体以及某些小鼠IgG抗体亚类（尤其是IgG1）具有低亲和力。另一方面，蛋白G与小鼠，山羊，绵羊和大多数大鼠IgG的Fc区结合良好。但是，它对兔IgG的亲和力低于蛋白A。当使用我们改进后的CUT＆RUN 方案时通常不需要二抗。原始的方案则需要二抗来确保融合蛋白与抗体的有效结合。
3、CUN&RUN是否可改造适用于RIP-seq?
改善CUT&RUN的操作步骤作用在RNA上，以作为RIP-seq的替代方案是有可能可以实现的。细胞质中的RNA如果缺乏5‘cap和3‘poly-A则易被降解，因此建议选用细胞核作为样本。由于核被膜不含胆固醇，所以不需要使用dignitonin。分离出来的细胞核可通过核被膜上的糖蛋白固定在ConA磁珠上，再加入抗体识别目的蛋白，然后加入pA/G-MNase靶向到抗体上，从而切割RNA。最后将RNA分离出来转录成cDNA并进行测序和定位。
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CUT&RUN的原理和成品试剂盒研究
CUT&RUN（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease）作为表观遗传学的研究的一种新型技术方法，对传统的方法进行了重大的修改，以消除ChIP固有的缺点。CUT&RUN的原理如何？有没有成品试剂盒？
CUT&RUN可用于绘制全基因组转录因子结合位点、染色质相关复合物、组蛋白变体和翻译后修饰的图谱。自该技术面世以来，已有多篇CNS文章利用CUT&RUN技术研究蛋白-DNA的互作。作为ChIP的高效替代方案, CUT&RUN在蛋白质-DNA研究中将会被越来越广泛地使用。
CUT&RUN原理：
CUT&RUN在细胞内利用抗体靶向定位目标蛋白, 再由pA/G-微球菌核酸酶（Micrococcal nucleasel, MNase）对目标蛋白两端的DNA进行切割，从而将目标蛋白质-DNA复合物释放到细胞外。
成品试剂盒：
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CUT&RUN优点如何？一篇文献足以
作为ChIP的高效替代方案, 你可能不知道CUT&RUN有多优秀，那小编就拿下面这篇文献来分析一下吧~
文献：Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers
随着技术的发展，ChIP-seq的改进可以实现TFs 6-8碱基对分辨率的映射，但实验结果还是存在很多问题，比如说ChIP的高背景限制了灵敏度，需要的细胞比较多以及交联和增溶产生的假象。而CUT&RUN相比于传统ChIP在细胞量和信噪比等方面的优势。
1）在整个实验过程中，pMNase的量对片段化的结果至关重要
fig1.两批样品500μl体积中，600,000个K562细胞，加入不同浓度的pA-MN，片段化之后，采用TapeStation 通过分析荧光强度来分析pA-MN对H3K27me3基因组片段化的影响。
2）CUT&RUN技术用于少量细胞，信噪比很好
研究者检测了100-6000个K562细胞的H3K27me3的基因组分布，发现在低至100细胞时，CUT&RUN仍可以很好地检测出H3K27me3的峰，而且在异染色质区也一样可以看到峰。
fig2.CUT&RUN可以检测低至100细胞的H3K27me3基因组分布（a）ENCODE数据库中的K562细胞的H3K27me3 ChIP-seq结果，及6000-100个K562细胞的H3K27me3 CUT&RUN结果。（b）CUT&RUN结果的散点图，以50bp为一个bin，相对于阴性对照IgG，6000细胞与100细胞有明显更强的相关性。（c）热图显示6000-100细胞的CUT&RUN结果有很好的相关性。
3）CUR&RUN技术检测的信噪比要比传统ChIP-seq高很多
研究者检测了转录因子CTCF的基因组结合位点，发现CUR&RUN技术检测比ENCODE的CTCF ChIP-seq的信噪比要高很多，而且只需1.25万细胞就能得到很高质量的结果。尽管用1000细胞则会损失一些峰。
fig3.用CUT&RUN检测CTCF的结合位点，比ENCODE中的CTCF ChIP-seq信噪比高很多。
本文图2、图3分析源自CST公司。
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来源：https://www.amyjet.com/featured/cutrun-2.shtml
