来宝网 2021/3/29点击3380次
蛋白定量BCA法，Bradford法，是2种常见的蛋白定量方法，关于这两种方法的原理，优缺点，以及操作步骤，下面将一一解析。
一、蛋白定量BCA（Bicinchoninic Acid）法
BCA (bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，562nm处有最高的吸收值，可在540-595nm测定其吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
特点：灵敏度高，操作简单，正常情况下可在45分钟内完成测定；且试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳。需要注意的是这种方法需要提前制作标准曲线。Abbkine定量总蛋白的蛋白质定量试剂盒（BCA法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，最低检测蛋白量达到5ug。
实验所需仪器及试剂：恒温水浴锅、可见光分光光度计、离心机、旋涡混合器、试管
操作步骤：
1.标准液制备：梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品。将8个EP管按照1到8进行标记，将BSA标准品稀释成1mg/mL工作液，准备浓度梯0，50，100，200，400，600，800，1000 ug/mL。
2.BCA工作液制备：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）
3.加样孵育：吸取20μL各个稀释浓度的蛋白质标准品或待测蛋白质样品，加入96孔板底部或试管中，向孔/管中再加入200uL BCA工作液轻轻摇晃混匀。在37°C下孵育30min，冷却至室温。
4.测定：冷却到室温后，以空白为对照，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值
5.将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。
浓度计算：
1.在excel表中输入对应的标准曲线值和蛋白样品值。（图中所示均为举例说明），选定标准曲线的OD值和标准品蛋白浓度。
2.点击excel表栏：插入-图表-XY散点图，并点击确定。
3.点击确定后会自动生成XY散点图，随意点击散点图中的任一的散点，右键添加趋势曲线。
4.点击趋势线的拓展栏，选择“更多选项”
5.选择“更多选项”，弹出“设置趋势图格式”的画面，点击“显示公式（E）”以及“显示R平方值”。一般R2值越接近1，表现标准曲线做得越好，根据标准曲线带入的样品OD值测出的蛋白浓度也越准确，一般要求为0.99几左右。
6.将样品OD值代入标准曲线的公式中，计算即得到待测样品蛋白的浓度。
考马斯亮蓝法（Bradford）
Bradford法也称作考马斯亮蓝法，是由Bradford于1976年建立的。该方法的原理是，带负电的考马斯亮蓝染料与蛋白质中碱性氨基酸相互作用。
特点：简单便捷、灵敏度高，Abbkine蛋白质定量试剂盒（Bradford法），线性标准曲线范围为50-1000 ug/ml，灵敏度25ug/ ml，最低检测蛋白量达到5ug。反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量。Bradford 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，如：K+ 、Na+ 、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、EDTA、DTT、TCEP 和β-巯基乙醇等。
需要注意的是：由于高浓度洗涤剂会影响检测结果的可靠性，必须确保样品中的SDS的浓度低于1％，Triton X-100低于0.1％，Tween 20,60,80低于0.06％，以及检测蛋白浓度的考马斯亮蓝和染色PAGE胶的考马斯亮蓝不是同一种物质，前者采用考马斯亮蓝G250，后者采用考马斯亮蓝R250，G250和R250分子基本骨架一样，但是G250多了两个甲基，与蛋白反应迅速，染胶慢且脱色困难，故用于蛋白定量；R250与蛋白反应较缓慢，染胶较快且易于洗脱，故用于PAGE胶染色。
以上两种蛋白定量方法：BCA蛋白质定量法&Bradford蛋白质定量法的使用场景，应该根据实验条件来选择，这样实验数据才会更可靠~
文章来源：蛋白定量BCA法 VS Bradford法，你支持哪一种？
http://www.abbkine.cn/protein-quantification-bca-bradford
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全血样品中如何收集保存游离cf-DNA和cf-RNA？
关于液体活检，来聊聊全血样品中游离cf-DNA和cf-RNA是如何保存和收集的。那么cf-DNA和cf-RNA是什么呢？
cf-DNA，就是cell free DNA，在血液中游离的自身DNA而已，这些DNA多是从身体的细胞或者血球破裂释放出来的，一般认为是无害的，很快会被自身清理掉，由此可见cf-RNA同理。
液体活检样本多种多样，目前来说，cf-DNA和cf-RNA：外周血中游离的核酸小片段DNA和RNA源自正常细胞或肿瘤细胞代谢与凋亡，具有极大的临床应用价值。
那么问题来了，如何收集保存全血样品中游离cf-DNA和cf-RNA的呢？
答案很简单——全血样品中游离cf-DNA和cf-RNA保存管。
Norgen cf-DNA/cf-RNA保存管是一种封闭的真空塑料管，用于在储存和运输期间收集和保存人全血样本中的cf-DNA、循环肿瘤DNA、cf-RNA和循环肿瘤细胞。将这些试管与Norgen的血浆/血清无细胞循环DNA纯化试剂盒或Norgen的血浆/血清RNA纯化试剂盒结合使用能够在非常小的洗脱体积中纯化和浓缩无抑制剂的cf DNA/ct DNA/cf RNA。
从诺根的cf-DNA/cf-RNA防腐管中回收的血浆也与任何其他cf-DNA和/或cf-RNA纯化方法兼容。纯化的cf-DNA、ct-DNA和cf-RNA与任何下游应用分析兼容，包括PCR、qPCR、rt-qPCR、甲基化敏感PCR、Southern印迹分析、基因表达分析、微阵列和NGS。
全血样品中游离cf-DNA和cf-RNA保存管的工作流程图：
使用前确保阅读产品说明书和操作规程
步骤：
重要：在抽血后立即将管倒转5次以确保防腐剂与样品均匀接触。
一次倒转是指手腕完全转动180度，手心处向内转变为手背处向内。
完成此步骤后，请勿再次混合cf-DNA和cf-RNA保存管的内容物。
重要：在制备血浆之前不能混合管内的内容物。任何混合都可能导致严重的溶血。
特点：
1.无固定剂的防腐剂，没有DNA的交联；
2.将cf-DNA和ct-DNA 和 cf-RNA在环境温度下保存长达30天，在37°C下保存长达8天；
3.在环境温度下将cf-RNA保存30天；
4.在环境温度下保存循环肿瘤细胞（CTC）长达14天；
5.运输后没有血浆体积损失；
6.防止溶血，可以更好地分离血浆；
7.防止血细胞凋亡和基因组DNA片段化；
8.产生高质量的血浆cf-DNA，ct-DNA和cf-RNA；
9.用10 mL采血管抽取8.4 mL血液。
全血样品中游离cf-DNA和cf-RNA保存管-各品类横向对比】
文章来源：全血样品中游离cf-DNA和cf-RNA保存管
https://www.amyjet.com/featured/cf-dna-rna.shtml
