来宝网 2021/3/17点击516次
荧光探针：在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其 荧光性质（激发和发射波长、 强度、寿命、 偏振等）可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。利用荧光探针可测定RNA和DNA的结构、研究DNA碱基损伤修复、辨别蛋白质分子中氨基的状态和蛋白质分子的活性区, 检测pmol级的蛋白质 ,区分不同构象的核酸以及有关药物的化学反应活性。
荧光染料又称为荧光探针, 因具备检测速度快、重复性好、用样量少、无辐射等优点，成为大家广泛使用的荧光标示剂。
由于大多数荧光染料不具备选择性，被固载在生物活性载体的荧光染料，可利用生物活性物质之间的选择性（抗原抗体，生物素链霉亲和素），或者通过染料分子用适当的修饰官能团，通过官能团之间的相互反应，实现对目标物质的靶向性标记，下面就给大家介绍常见的几类活性荧光染料啦
1.琥珀酰亚胺酯（Succinimidyl esters）/ NHS酯
琥珀酰亚胺又称为丁酰亚胺或丁二酰亚胺，是一种无色针状结晶或具有淡褐色光泽的薄片固体，味甜。用于标记抗体，蛋白质，肽，胺修饰的寡核苷酸和其他生物分子上的游离氨基（-NH 2）
2.马来酰亚胺（Maleimides）
马来酰亚胺是一种有机物，化学式为C4H3NO2，片状结晶，易升华，溶于水、乙醚和乙醇。用于标记抗体，蛋白质和肽上的巯基
3.叠氮化物(Azides)
叠氮化合物是电子传递系统的抑制剂，能与细胞色素形成配位化合物，阻止细胞色素氧化酶氧化型a3组分的还原作用。通过点击化学法（Click）标记乙烯基
4.炔烃(Alkynes)
炔烃，为分子中含有碳碳三键的碳氢化合物的总称，通过点击化学方法标记叠氮化物
5.羧酸(Carboxylic acids)
分子中具有羧基（—COOH）的化合物称为羧酸。经碳二亚胺预活化后用于标记胺或用于醇的Steglich酯化
6.氨基(Amines)
氨基(Amines)具有游离氨基的荧光染料，用于与各种亲电子化合物（如活化的酯和环氧化物）偶联。
氨基活性荧光染料：
Cy3 胺（Cyanine3 amine）、Cy5 胺（Cy5 amine）、Cy5.5 胺（Cyanine5.5 amine）、Cy7 胺（Cyanine7 amine）、Cy7.5 胺（Cy7.5 amine）、磺酸基-Cy7 胺（Sulfo-Cyanine7 amine）
羰基活性染料：
Cy5 酰肼（Cy5 hydrazide）、Cy5 Boc-酰肼（Cy5 Boc-hydrazide）
炔烃活性染料：
1-Ethynyl pyrene、3-Ethynyl perylene、Cyanine3 alkyne、Cyanine5 alkyne、Cyanine5.5 alkyne、FAM alkyne, 5-isomer、Sulfo-Cyanine5 alkyne
文章来源：http://www.bio-review.com/nhs-esters/
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精子质量检测丨EXBIO精液检测分析试剂盒
精子质量检测是诊断男性不育的重要手段，精液的常规分析费时费力，检测指标单一，只能反映精子的形态特征和有限的功能，无法准确且全面的反映精子质量。将流式细胞术（FCM）用于精液检查，可把定性的描述过渡到定量的研究，并可进行数据统计，大大提高了实验结果的科学性，而且可对精液进行高通量、多参数分析，能极大的拓展精子学这个生殖方面的子领域。
EXBIO SpermFlowEx Kit，基于流式细胞术精液检测分析试剂盒各指标参数的处理与分析如下：
（一）精液中精子及白细胞计数
白细胞是精液中常见的一种细胞。白细胞可通过吞噬作用、产生活性氧，分泌一些细胞因子等途径诱导细胞凋亡，导致精子数量减少。研究发现，白细胞计数增高与精子参数(包括密度)的降低存在明显相关性。FCM检测是根据白细胞所表达的共同抗原，用结合荧光染料的单克隆抗体CD45标记白细胞进行检测，相比于直接镜检、过氧化物酶染色等其他检测手段，FCM可准确区分白细胞与生精细胞，操作简便，结果可靠，且可进一步区分白细胞各亚群。
操作步骤：
吸取50ul稀释好的精液至试管中
加10ul CD45 PE-Cy5抗体溶液
混合样品，在室温下孵育20分钟
加50ul荧光计数标准液（首先，将标准液混合均匀，加几滴到干净的微管中，然后用移液器从微管中吸取精准体积的标准液加到精子样本管）
加5ml PBS，混合后上流式细胞仪
（二）精子存活率
PI (碘化丙啶, Propidium Iodide)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色，只有没有活力的精子才会被碘化丙啶溶液染色。因此用FCM结合DNA荧光染料PI，可以反映出精子的存活率。
操作步骤：
吸取50ul稀释好的精液至试管中
加10ul PI溶液
混合均匀，在室温下孵育20分钟
加0.5mlPBS，混合后上流式细胞仪
结果
将测量数据可视化为前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）点图。 如图3所示，在精子细胞周围设门。然后在直方图中可视化精子细胞（图4），其中X轴表示PE-Cy5或PerCP通道中碘化丙啶的荧光强度。使用适当的门分离阳性和阴性精子细胞。 阴性群体代表有活力的精子，而PI阳性群体则代表无活力的精子。 精子的生存率由所有精子细胞中有活力的精子的百分比表示。
（三）顶体完整性和顶端体蛋白的存在
在受精过程中，哺乳动物刚射出的精子在体内要经过获能和顶体反应，才能穿入卵细胞并与其融合，完成受精。因此检测精子的顶体状态，有助于反映精子的受精能力。精子顶端体蛋白（intra-acrosomal protein），是一种在成熟精子的顶体膜上特异性表达的蛋白，该蛋白在几乎所有人类精子样本中都能被检测到，且表达量稳定。利用标记了FITC荧光素的顶端体蛋白抗体，特异性地标记在顶体膜上，其荧光强度可反映顶体大小，因此通过测定荧光强度可间接反映顶体结构的完整性。
操作步骤-顶体的完整性
吸取50ul稀释好的精液至试管中
加1 ml PBS，混合后，150 g离心5分钟，去上清
再洗一次（重复步骤2）
向沉淀中加10ul Intra-acrosomal protein FITC抗体
混合均匀，在室温下孵育20分钟
加0.5mlPBS，混合后上流式细胞仪
操作步骤-是否存在Intra-acrosomal protein（需透化）
吸取50ul稀释好的精液至试管中
加1 ml渗透液
混合均匀，室温下孵育15分钟
150 g离心5分钟，去上清液
向沉淀物中加入1 ml PBS，混合均匀，以150 g离心5分钟
再洗一次（重复步骤5）
加入10 ul Intra-acrosomal protein FITC抗体
充分混匀，室温下孵育20分钟
加5mlPBS，混合后上流式细胞仪
结果：
可视化抗体（顶端体蛋白FITC）对可渗透和未渗透样品染色的前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）点图，并在精子周围设门，如图3所示。然后在直方图中可视化精子事件（见图5-7），其中X轴表示荧光强度 在FITC荧光检测器中。 使用适当的门将阳性和阴性精子分开。 图5显示了阳性精子含量低（<30％）的未透化非病理性精子事件。 阴性代表具有完整顶体的精子，阳性代表具有受损的顶体的精子。图6显示了渗透性非病理性精子，其中阳性精子占主导地位。 阳性精子表明存在顶端体蛋白。图7显示了未渗透的病理性精子，其中顶体受损的阳性精子的含量高（> 30％）。
精液检测分析试剂盒链接：
https://www.amyjet.com/brand/EXBIO.shtml
