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荧光定量技术服务
 
一、项目简介

Real Time PCR法是实时监测解析PCR扩增量的方法。因其无需电泳，大大减低了实验污染的机率，且具有快速、可对检测靶基因定量而倍受青睐。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞、细菌等mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。我们为您提供全套实时荧光定量PCR技术及解析服务：您只需提供组织或细胞标本，我们为您完成RNA抽提，cDNA制备，实时定量PCR，标准曲线制备及数据分析的所有步骤。

1、TaqMan探针方法
该技术以美国 ABI 公司为代表。 PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸片断，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter'' R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher'' Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

2、SYBR Green I嵌合荧光法
SYBR Green I荧光染料技术原理：SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料（图2）。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。

3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
      SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。

二、服务项目

1、定性分析
PCR反应结束后的PCR产物无需电泳检测，可以通过Real Time PCR方法，简单快速地对目的基因进行高特异性、高灵敏度的检测，同时闭管操作的实时检测可以有效防止反应产物的污染。本技术可以广泛应用于病毒、病原菌等致病微生物的检测以及各种生物品种的鉴定等。

2、绝对定量
绝对定量首先必须构建与检测样品目的基因具有相同序列的标准品。使用已知浓度的标准品制作5 个点以上的标准曲线后，可以使用标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量（起始拷贝数）分析。

3、相对定量（mRNA表达量分析）
基因表达的研究一般采用相对定量的方法。相对定量法必须对样品的目的基因和参比基因内标同时分别进行定量，然后求出对于参比基因的目的基因的相对量。通过对样品间的目的基因的相对量进行比较，可以对不同样品间的mRNA进行表达量分析。参比基因通常选用β-actin。通过同时对参比基因的实时检测，可以对样品之间由于起始细胞数不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量误差进行校正，达到在严格意义上对样品之间的mRNA表达量进行分析之目的。

三、服务流程

1、客户以电话或邮件形式告知公司要进行的实验基因名称和标本数目；

2、公司派专业技术人员与您洽谈实验费用和荧光定量探针设计方案（序列和设计有公司负责）；

3、签订实验技术服务合同，交费用的50%作为订金（若实验没有结果或结果未达到客户要求，订金不退）；

4、公司合成荧光定量探针、派相关人员取回实验标本；

5、进行RNA抽提、鉴定、cDNA合成实验；

6、进行实时荧光定量PCR实验（每个标本的每个基因均进行3倍平行孔实验，保证获得准确、无误差、客观的样品基因扩增数据）；

7、通过统计分析软件计算目的基因的mRNA表达数据；

8、提供完整的实验报告（实时荧光扩增曲线图、分析数据、实验步骤、试剂仪器）；

9、客户交齐全额费用。

四、服务要求

1、请认真填写Real Time PCR检侧技术服务委托单；

2、请您提供新鲜的且尽量多的材料（各种材料的 RNA 提取量请参照“总 RNA 的提取”），或直接提供纯化好的总RNA（大于5μg/样品）；（各种材料的 DNA 提取量请参照“ D NA 的提取”），或直接提供纯化好的DNA（大于5μg/样品) ；

3、如果提供的材料为细胞或组织，应保证材料新鲜：
细胞样品：细胞培养至少达105以上，培养后细胞请勿做任何处理。
组织样品：离体后30分钟内入液氮保存，动物组织为5mg以上。
血液样品：分离白细胞后，-70℃保存。

4、请通过 E-mail 提供已知的全长基因序列；

5、请提供尽可能详细的背景资料： DNA/ RNA 来源、丰度等。

配套服务项目：
 
1、引物（探针）设计和筛选：
根据您提供的基因序列，我们为您提供引物（探针）的设计和筛选服务。

2、基因组DNA提取组织：
新鲜样品或-70℃保存样品，避免反复冻融提供样品量500mg以上，剩下归还（无致病性，除脂肪组织、粘液状组织以外）。
细胞：新鲜样品或-70℃保存样品，避免反复冻融提供样品量105以上。
植物： 提供样品量500mg以上（新鲜叶片，或4℃保存一周内的叶片），剩下归还（新鲜组织，植物干粉得率较低）。
原核生物：提供样品量108CFU或者0.5个麦氏单位以上（非致病性，提供菌株和培养基信息；致病性，提供灭活菌液等）。

3、基因组RNA提取
组织：新鲜样品或-70℃保存样品，避免反复冻融提供样品量500mg以上，剩下归还（无致病性，除脂肪组织、粘液状组织以外）。
细胞：新鲜样品或-70℃保存样品，避免反复冻融提供样品量105以上。
植物：提供样品量500mg以上（要新鲜叶片，或4℃保存一周内的叶片），剩下归还。
原核生物：提供样品量108CFU或者0.5个麦氏单位以上。

4、质粒构建：
试验包括：PCR产物回收、连接转化、克隆鉴定和质粒提取。

5、RT-PCR反应
请您按要求提供试验样本（详见基因组DNA提取、基因组RNA提取和反转录样品要求）；或提供纯化好的DNA样品5μg。 

程伟
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