多功能酶标仪技术的革命——LVF光栅在FRET和BRET分析中的优异表现
来宝网 2015/6/21点击1069次
在多功能酶标仪中，为了分离某一特定波长的单色光我们有两种技术选择——滤光片或者光栅。与光栅相比，滤光片系统往往具有更好的灵敏度，因为滤光片具有更好的透光率和更宽的带宽。而光栅系统的好处是可以提供波长选择的灵活性，不需要购买或安装特定波长的滤光片。尽管如此，很多用户都发现许多应用在光栅系统上达不到理想的效果，有些应用甚至根本无法实现。
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例如在检测GFP，mKate，mOrange和CFP-YFP等荧光蛋白时，光栅型酶标仪得不到理想的效果，在FRET和BRET等双发射分析中更是如此。光栅型酶标仪无法实现这些应用的一个明显原因是我们需要30nm以上的带宽，实际上，在一些BRET分析中我们需要60到100nm的带宽，而目前传统的光栅往往只有狭窄的固定的带宽或者有限可调的带宽（不超过30nm），根本无法满足检测要求。另一个原因是这些应用的信号比较弱，发射光远远少于常用的染料，如FITC或者rhodamine，而光栅的透光效率又远远低于滤光片，光强损失太大，势必降低灵敏度。
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为了既满足波长选择的灵活性又能得到更高的灵敏度，德国BMG LABTECH公司的工程师们研发出了革命性的线性渐变滤光片光栅，简称LVF光栅 （Figure 1）。
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LVF光栅技术包含一块线性渐变短波通滤光片和一块线性渐变长波通滤光片，当两块线性渐变滤光片恰当排列的时候我们不仅能分离得到特定波长的光线，还能实现8到100nm带宽的任意选择。LVF光栅可以轻松实现以前需要滤光片才能完成的分析，例如FRET和BRET。
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LVF光栅的高灵敏度除了因为更宽的带宽，还有两个原因，一是LVF光栅是基于滤光片的透射原理而不是传统光栅的衍射；二是由于光路设计的不同， LVF光栅通过直接的光学组件取代光纤来传导信号（光纤传导会造成光强的损失）；因此，LVF光栅可以提供比传统衍射光栅多5到10倍的光线，从而大大提高了灵敏度。目前LVF光栅已经被运用于BMG最新一代的多功能酶标仪——CLARIOstar。
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对于科研工作者来说，一个巨大的挑战是如何将基于显微镜的荧光蛋白分析转化为基于微孔板的分析。现在有了LVF光栅我们可以在多功能酶标仪上选择与显微镜相同的波长和带宽，从而实现显微镜和酶标仪之间的无缝衔接。
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例如，Figure 2显示的是分别用共聚焦显微镜和CLARIOstar检测HEK293细胞中mTFP1和YFP之间的FRET。
在显微镜上，我们选择波长480nm、带宽30nm和波长535nm、带宽45nm的两块滤光片来分别检测mTFP1和YFP的信号，
在CLARIOstar上，我们通过LVF光栅选择相同的波长和带宽做为起点，经过优化之后我们在酶标仪上得到了与共聚焦显微镜相同的FRET效率，从而实现了从显微镜分析到高通量微孔板分析的无缝转化。
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另一个说明LVF光栅可以媲美滤光片的应用是BRET，跟FRET一样，BRET也需要同时检测两个发射光信号，不同的是往往需要更大的带宽（60到100nm），因此，由于带宽的限制，传统的光栅型酶标仪基本无法实现BRET分析。然而，CLARIOstar的LVF光栅却可以得到媲美滤光片的结果（Figure 3）。
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LVF光栅是目前市场上唯一可以实现任意波长，任意带宽选择的酶标仪技术，这种突破性的设计使得CLARIOstar可以实现任意的荧光和发光检测，做到“任何波长、任何带宽、何任检测”都可以轻松实现！
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