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肿瘤在不同氧气量的代谢相互作用
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Monitoring the interplay between oxygen availability and metabolism in tumour biology
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Conn Carey1 , Michelle Potter2 , Luned Badder2, Karl Morten2,, James Hynes1
1 Luxcel Biosciences Ltd, Cork, Ireland
2 Nuffield Department of Obstetrics & Gynaecology, Uni. Oxford, Oxford, United Kingdom
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要详细了解肿瘤生物学, 关键是知道氧气量和代谢之间的相互作用关系。 尽管有充足可用的氧，肿瘤偏向缺氧代谢会导致糖酵解增加，也会引起转录反应改变和遗传不稳定性，这种现象被称为Warburg效应。但是，由于缺乏有效的体外工具能够测量这些参数，科研人员对氧气量和关键的代谢指标改变所知非常有限。
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越来越多科研人员发现现有的细胞培养条件是在高氧状态 （hyperoxic state）下进行的。现在更多科学家希望采用跟生理状态更接近的氧浓度进行培养。 然而，控制环境氧浓度相对容易，但关键信息是细胞/组织的临界氧浓度(tissue oxygenation) 。在这里，我们向您推荐一种新型的荧光板阅读器(BMG Labtech Omega /ACU细胞专用读板机) 配合Luxcel 公司新开发的试剂盒，可以并行监测细胞内的氧气浓度（MitoXpress-Intra）和糖酵酵解通量glycolytic Flux（pH-Xtra™）。
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这种测量可以详细了解细胞真实的含氧量及其所带来的糖酵解活动水平。 实验使用BMG Labtech Omega /ACU细胞专用读板机配备大气控制单元（ACU）进行模拟肿瘤脱氧环境，数据揭示细胞单层和所在的环境氧气浓度有着显著差异，该差异在一般体外分析中是不太会注意到的。
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测量原理是基于细胞内吞MitoXpress Intra®氧气探针，胞内氧气能淬灭探针所发出的荧光信号。随着细胞的呼吸作用，细胞内的氧浓度降低甚至耗尽，MitroXpress Intra®探针所发出的荧光信号，被淬灭的越来越少，荧光信号则相对越来越强。 通过比例测量时间分辨荧光强度（Fig 1）。实现实时测量细胞内的分子氧瞬时变化，该系统也能对多个样品的代谢活性瞬态变化进行快捷的分析，跟传统细胞外检测方法比较，能提供更全面的缺氧研究参数。
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此外，通过Luxcel pH-Xtra 探针测量（在平行井，或同一井）胞外酸化率(ECA) ,可同时监控细胞糖酵解通量 （glycolytic flux），评估细胞的能量潜力（Energy Budget）。数据显示代谢中的细胞单层（或3维细胞团）的氧浓度跟实验施加的氧气浓度，有着显著差别；特别是在生理相关的氧浓度，其影响更大，从而影响细胞的氧化磷酸化和糖酵解ATP通路平衡。
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测量胞内氧气
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通过测量细胞单层内的氧化率，可以评估一些细微短暂的代谢活动变化，这是一般标准的胞外氧耗率测量做不到的。胞内氧化率也允许评估特定激动剂对代谢的详细影响。样本数据列于Fig2。
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Fig 2.
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Fig 2. 抗霉素 (Antimycin) 及FCCP对HEK293T细胞单层的氧化水平的影响。抗霉素是一个ETC抑制剂，而FCCP则是ATP合成抑制剂。探针信号开始时反映了稳定态的氧水平，由于细胞消耗氧，所以这水平较环境氧水平低。抗霉素抑制氧气消耗，导致氧弥散到单层并把浓度升回到周边空气中的含量。 FCCP导致增加氧气消耗，所以细胞单层中的氧浓度迅速下降直到新的稳定状态。
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Fig 3.
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Fig 3.降低未经处理（呼吸）和抗霉素处理（非呼吸）细胞周边氧浓度并监测单层氧的变化。通过Fig3 BMG Labtech Omega/ACU读板机把氧浓度步退到21％至5％之间。MitoXpress® Intra 信号反映了细胞层实际的氧浓度。注：细胞呼吸驱使细胞单层的氧浓度比ACU设计的浓度更低，在低氧环境下其影响为更明显。
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测量糖酵解（ECA）
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Fig4.
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Fig4. pH-XTRA：pH反应(A)，原始数据输出(B)，测量糖酵解抑制(C)
A）光学特性：经同质修正后pH探针的发射光谱在pH =7.5，7，6.5 及6。注意在pH值为7.5及6间信号增加7.5倍
B）原始数据输出：Fig3列出梯度稀释HepG2细胞浓度。增加细胞数量造成酸化率增加。％CV值 <5％显示实验数据的高重复性。
C）测量糖酵解抑制：加入2DG后因竞争性抑制减少葡萄糖摄取。 处理后的细胞表现出戏剧性及即时性和对剂量依赖的胞外酸化率下降现象。
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氧气浓度及糖酵解流量 –细胞单层
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Fig 5.
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Fig 5. HepG2细胞经抗霉素A (Antimycin A) 和草氨酸 (Oxamate) 处理后之pH-XTRA动力学荧光信号(A) 和氢离子浓度(B)。Fig5C列出经处理及没处理之细胞有着明显的酸化率差异。而Fig5D显示低氧气浓度对胞外酸化率的影响。
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一）测量糖酵解抑制作用：经草氨酸处理后乳酸脱氢酶 (LDH) 受到抑制，减少酸化。抗霉素处理后细胞增加糖酵解流量以维持ATP量，所以增加酸化率。
二）低氧增加Warburg 反应：氧浓度从21％降低至6％，导致酸化率增加。
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氧浓度与3维培养
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Fig 6.
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Fig 6. 测量HepG2 3D RAFT (TAP Biosystems)细胞结构之胞内氧气量： 通过BMG Labtech Omega/ACU 细胞专用读板机 调节周边氧气量在21 ％和1％之间 (A)，及跨越各种氧浓度下线粒体经调节剂处理之反应(B)。
（1）细胞供氧低于溶液中的氧：使用MitoXpress® Intra 测量细胞的氧含量，发现胞内氧气水平跟周边水平（ACU水平）有着显著分别 （A）。
（2）缺氧环境：溶液中的氧气仍是约 3 ％，但细胞已出现缺氧呼吸（A） 。
（3） 测定线粒体毒性：抗霉素，鱼藤酮 (Rontenone) 和FCCP处理后改变细胞的氧浓度，反映线粒体毒性。
注： MitoXpress®Intra 探针是在不同处理剂添加前16小时前添加的。该探针非常稳定并可逆，可以在特定氧气条件下进行实时监控（多个）药物对细胞的影响。
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在特定控制氧气量时加药
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Fig 7.
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Fig 7. 在周边氧浓度为21％下使用MitoXpress®- Intra测量经药物处理后之HepG2 3D RAFT细胞团氧含量之改变。
（1）药品添加：加入线粒体解偶联剂FCCP，引起3D RAFT细胞团出现短暂但显著的深化缺氧。
注： MitoXpress®Intra 探针非常稳定并可逆，可以在特定氧气控制条件下进行实时监控（多个）药物对细胞的影响。不需要额外的化学程序。
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细胞单层及3D细胞团的代谢图谱
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通过使用胞内氧（MitoXpress-Intra）和糖酵解通量（pH Xtra）试剂盒及BMG Omega/ACU 细胞专用读板机 （在平行井或同一井）允许方便地测量细胞能量潜力 (Energy Budget)，从而可对细胞系进行代谢图谱探究。
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虽然测量2D细胞单层培养也能得到非常多资料，但通过胞内氧（MitoXpress-Intra）和糖酵解通量（pH Xtra）试剂盒及BMG Omega/ACU 细胞专用读板机可以方便地测量3D 细胞团的能量潜力，并提供了更多的更接近生理状态下的细胞相关数据。例如利用球细胞团 （Spheroid）研究肿瘤生物学。Fig8显示出从三个细胞系产生的球细胞团的氧浓度。球细胞团内的缺氧深度可能相当大，缺氧程度跟细胞团大小和代谢状态相关。MitoXpress®Intra细胞穿透性染料允许测量整个球细胞团的氧浓度*。
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Fig 8.
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Fig 8. 氧化细胞系产生的球细胞团的胞内氧气量
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代谢图谱 ： 3个细胞系有着不同的胞内氧气量/呼吸需要。 RD 及New U87MG均比环境氧气量低。
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结论
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MitoXpress® - Intra和pH- Xtra为测量细胞单层的氧气量及细胞能量潜力提供了一个易于使用的解决方案。
两个探针都是稳定并可逆的，不需要额外的化学程序（不需矿物油层覆盖细胞）。
MitoXpress® - Intra和pH- Xtra可以在平行井或同一井内进行使用，使用高端分辨荧光读板机（BMG LABTECH FLUOstar Omega/ ACU）可进行准确测量。
这研究显示在环境，培养液，及细胞层的氧气量有着显注的差异，- 所以显出了测量细胞层内氧气浓度的重要性。 其效果在3D RAFT 细胞团及球细胞团中更显著。
改变 “可用氧气量” 可以显著引起细胞代谢变化，其中包括糖酵解流量显着增加。
MitoXpress® - Intra和pH- Xtra可提供高通量解决方案去衡量药物在已知及控制的氧气水平下对细胞代谢的影响。
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材料与方法 ： 请参照原文
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