Indoor过敏原产品中常见问题解答
来宝网 2012/8/9点击1845次
过敏原：
Q1 过敏原应该怎样保存？
A 过敏原应该在-20℃冷冻保存。
Q2 过敏原是怎样纯化的?
A 不同的过敏原纯化的步骤是不同的。我们通过亲和层析，离子交换，疏水性相互作用，用疏水性相互作用联合尺寸排除色谱法纯化天然的，重组的及LoToXTM过敏原。
Q3: 提供的抗原是在什么缓冲体系中？
A天然和重组的抗原是在无防腐剂和无载体的磷酸盐缓冲液中的，pH 7.4，无菌。 LoTox™抗原是在有防腐剂，无载体，无内对手，无菌的磷酸盐缓冲液中的，pH 7.4.。
Q4 LoTox™ 过敏原是什么?
A LoTox™过敏原内毒素水平很低，低于0.03 EU/µg 蛋白，是用T细胞，APC细胞，树突状细胞做人类和鼠细胞研究的理想过敏原。
Q5 我的T细胞研究为什么要用 LoTox™ 产品?
A LoTox™ 产品是理想的是因为它几乎不含内毒素并且可以避免有内毒素引起的T细胞反应。
Q6 为什么要用纯化的过敏原，而不是过敏原提取物?
A 过敏原提取物是非均质的，包含非过敏原的蛋白和其他大分子。研究者经常用提取物是因为他们需要高T细胞应答，但这些信号的判读是不可靠的。应答的特异性不能被确认，很有可能这个应答是由非过敏原蛋白引起的，如IgE和IgG抗体应答，组胺释放实验和动物模型。我们强烈推荐在内毒素可能干扰细胞应答的任何细胞研究中使用LoTox™ 产品。
Q7我应该如何选择天然或重组过敏原？
A 重组过敏原与其天然的过敏原结构非常近似，与IgE抗体结合的实验结果也非常近似。毕赤酵母表达的重组蛋白组成糖分过多可能会干扰与IgE的结合。我们提供的重组过敏原LoTox™ Fel d 1 (LTR-FD1D), rBla g 2 (RP-BG2) 和 rDer p1 (RP-DP1D)是去糖基化的产品。
Q8 我如何激活Der p 1的半胱氨酸蛋白酶活性?
A Der p 1 由 5 mM半胱氨酸或1mM二硫苏糖醇激活而再生巯基，使其在纯化中氧化。(Gough et al. Journal of Experimental Medicine, 1999).
Q9 我应用何种底物来检测 Der p 1的半胱氨酸蛋白酶活性?
A DTT依赖的半胱氨酸蛋白酶活性可以在荧光实验中通过荧光肽底物Boc-QAR-MCA来检测。
Q10我需要激活 Der p 丝氨酸蛋白酶活性吗?
Q11 我应该用哪种底物来测试Der p丝氨酸蛋白酶的活性?
A DTT依赖的丝氨酸蛋白酶活性可以在荧光实验中通过荧光肽底物Boc-QGR-MCA来检测。
MARIA™
Q1 MARIA™ 试剂盒是冷冻保存还是在室温下保存?
A 都不是，试剂盒和所有的试剂都应保存在4℃冰箱中，这是很关键的。冷冻会破坏试剂。N
Q2 MARIA™ kit的有效期是多久?
A 假如保存得当的话，试剂盒在收到后的6个月内都说是有保障的。
Q3在实验前有没有必要将样品离心？
A 是的，MARIA™ 是基于微粒的实验，所以将样品中异质的颗粒减少到最小是很重要的。
Q4 你们推荐的样品稀释比例是多少?
A 推荐的样品稀释比例取决于您样品的类型及您研究所需达到的灵敏度。对于房屋灰尘提取物来说，我们推荐将样品以 1/10, 1/100 和1/10,000稀释，这将使您达到较低的检测限0.1-0.9ng/ml(相当于0.002-0.012µg/g灰尘)。
如果您不需要这么高的灵敏度，只需将样本用1/100和10,000稀释，灵敏度水平就为1-6ng/ml (灰尘0.02-0.12µg/g)。这样您每块板子可以检测35个样品。
空气过滤器提取物中的过敏原浓度要更低些，分析这类样本，我们通常不稀释，或以1/10和1/50稀释。
Q5 我应该如何进行系列梯度稀释?
A1对于系列稀释1/10, 1/100 和 1/10,000:
每个样品准备三个微量离心管，管1作1/10稀释，将10µL样品加入到90µL实验缓冲液中，管2中加入90µL实验缓冲液，再加入管1（1/10稀释）中的10µL液体，涡旋振荡混匀。管3中加入990µL实验缓冲液，再加入管2（1/100稀释）中的10µL液体，涡旋振荡混匀。50µL of each prepared dilution are used in the MARIA™ 实验中每种稀释比例用50µL 。
A2 对于系列稀释1/10和1/50:
每个样品准备两个微量离心管:管1中加入90µL实验缓冲液，再加10µL 未稀释样品，涡旋振荡混匀。管2中加入80µL实验缓冲液及20µL管1中稀释过的样品，涡旋振荡混匀。
Q6实验缓冲液必须要灭菌吗?
A 是的！Yes! 未灭菌的实验缓冲液有较高的颗粒负荷，这会干扰xMAP系统的检测。它会导致高微粒聚集比率，读板时间可能会增加3-4倍。
Q7 ELISA洗板机可以用于MARIA™ 实验吗?
A 不可以。翻转板子或重新板中的孔会洗掉微球。所有的洗脱步骤都需要通过多头抽真空装置来过滤，试剂盒中有提供滤板。
Q8 在孵育过程中我需要摇动板子吗?
A 不需要。在每步孵育前，微粒和事件要通过剧烈吹打使微粒和试剂充分混匀。不需要在孵育过程中晃动。
Q9 在暗室孵育的重要性是什么？我可以将板子放在工作台上吗?
A 所有的孵育必须在暗室中进行，否则微球会丧失其可被荧光辨别的标记。
Q10在孵育过程中我需要用铝箔纸封住板子吗?
A 我们通常用配套的盖住封住板子，孵育时将其放在空的抽屉中。
Q11 我要用什么仪器读板?
A 试剂盒只能与Luminex公司基于激光的荧光分析检测仪相配对：Luminex® 100, Luminex 200 和其他来自Luminex公司仪器或授权的经销商包括Bio-Rad 实验室(赫拉克勒斯, CA )、Qiagen 公司 (巴伦比亚, CA) and MiraiBio (南旧金山, CA))的Luminex仪器。我们使用Bio-Plex 仪器及其Bio-Plex管理软件(Bio-Rad, Hercules, CA).
Q12 检测每个分析需要使用多少微粒？
A我们推荐每个分析物用100个微粒以求最好的重复性。
Q13 我应选择怎样的拟合曲线?
A我们使用5个参数的logistic (5PL)曲线拟合。(该拟合曲线可以很容易的在Bio-Plex 管理软件中找到)
Q14我应该怎样决定标准曲线中可用的部分?
A1 如果曲线底端的荧光强度（FI）接近空白对照的FI，则不要使用在空白对照的FI加减3个空白对照标准差之内的FI。
A2 我们通常不使用在曲线顶部平直部分内FI的数据。这意味着我们通常排除Der p 1, Der f 1, Der p 2, Fel d 1, Can f 1, Rat n 1 和Mus m 1测得曲线顶部的2-3个点。Bla g 2 曲线的顶部是可用，然而底部的3-4个点就太接近空白对照数据了（看上）。
A3一些软件包，如Bio-Plex Manager® (Bio-Rad, Hercules, CA) 会在输出的Excel文档中自动显示期望值与实测标准值。我们使用这个功能作为额外的质量控制和唯一使用值，并且实测值和期望值的比率在15%之内。
A4 变异率（CV%）应在两个标准差之间没有超过15%。如果不是这样，您的移液器和移液过程的准确性需要被检测。
Q15用不同的样品稀释倍数我得到了不同的结果，我应该怎样选择正确的结果?
A 从不同的样品稀释倍数获得不同的结果，这是取决于您样品中过敏原的浓度。有很多标准供您选择正确的结果。
只选择落入可用MFI范围的结果。如果多于一倍的稀释倍数得到相似的结果：取平均结果。除去Der f 1 外的所有分析物：如果稀释倍数增高而结果升高：选择基于最高稀释倍数，含有很少Der f 1的样品与特定的灰尘提取物中底物出现低水平的干扰，并通过高稀释倍数的计算而增大。如果您观察到这样的结果如1/10= 7ng/ml, 1/100=74ng/ml, 1/10,000=4500ng/ml，那么就会出现上面所说的效应。在这种情况下，使用1/10稀释得到的结果，除非这个结果达到~100ng/ml ，若是这个点，则您可以信赖更高稀释倍数所得到的结果。这种异常现象在我们所检测样本中的比率<5%，并且只出现在Der f 1低水平的样本中。
Q16 我可以获得 MARIA™ 技术的培训吗?
A可以的，我们在美国维吉尼亚州夏洛特维尔的公司中安排了一年两次的培训课程，请查询我们的网站以获得更多的信息。我们同样提供基于一年的循环MARIA™客户培训
A可以的，我们在美国维吉尼亚州夏洛特维尔的公司中安排了一年两次的培训课程，请查询我们的网站以获得更多的信息。我们同样提供基于一年的循环MARIA™客户培训
ELISA
Q1 Der p 1 ELISA 试剂盒 EL-DP1和EL-DP1A的区别是什么?
A INDOOR 推出的两个检测Der p 1 的ELISA试剂盒，实验中与之结合的单抗是不同的。
EL-DP1:捕获单抗为5H8 ，生物素标记的单抗为4C1
EL-DP1A: 捕获单抗为10B9，生物素标记的单抗为5H8
最广泛使用的ELISA试剂盒为EL-DP1 (5H8/4C1)生物素4C1单抗在Der f 1 ELISA (EL-DF1)试剂盒中也有使用. EL-DP1推荐用于大多数常规灰尘和空气样本检测Der p 1。然而在EL-DP1实验中一定程度上存在与Der f 1的交叉反应，约为2% (参见 Luczynska et al, J Immunol Meth, 1989)。在常规分析中，这种水平的交叉反应不显著。
EL-DP1A试剂盒与Der f1的交叉反应<0.1% ，可应用于区分Der p 1 和Der f 1。举例来说，过敏原生产商用于确定他们灰尘螨培养的样本没有交叉污染。EL-DP1A分析与EL-DP1试剂盒的敏感性水平相同(1-2ng/ml)。
Q2我们注意到实验显影非常慢(并且从未打到过 OD 2.0). 这有问题吗？
A 您的结果明显存在问题。控制曲线在最高浓度的读值应在OD 2.0-2.4 ，敏感度应下至1-4ng/ml。如果您所有的实验，OD值都没有达到2.0 ，那么您实验的底物和显色方面可能存在问题。
A 在储存中所有生物素化的试剂是不是一直处于冷冻状态？这会减小这些单抗的敏感性
A 您是否混用了试剂或使用缓冲液片剂？我们发现一些缓冲液片剂不如新鲜制备的溶液有用。所有溶液通常在4℃保存不超过1个月，并不使用硫柳汞。
A 是否有试剂使用过叠氮化钠作为防腐？这会阻止显色，因为叠氮化钠是过氧化物酶的抑制剂。
A 在为ABTS配置溶液B时，使用的磷酸钠形式是否正确？磷酸钠必须是二元的，即Na2HPO4·7H20
A ABST溶液中是否加了足量的过氧化氢？每毫升ABST溶液中要加入1µl 30% H2O2。
A链霉菌抗生物素蛋白-素过氧化物酶是否被正确稀释了？
A柠檬酸盐缓冲液的pH值是否正确? ABTS溶液的pH值应为4.2，并在调节前就应靠近这个pH。如果偏离较远，溶液A或溶液B或他们的组成就可能是错的。
A 洗板机污染有时可能会妨碍显色，导致显色非常缓慢，或达不到OD 2.0.洗板机应当定期清洁。
A直接通过窗户外的日光曝光会导致上述问题，孵育时让板子远离窗户。
Q3 我们实验的背景值很高，这是什么原因引起的?
A 通常当二抗是兔的多克隆抗体时，实验的背景较高。背景值通常在0.15OD左右。其他引起高背景的原因可能是：
A过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体的来源问题。我们使用的为Biosource International和Jackson实验室产品。这两个抗体的实验背景都非常低，BioSource电话为: 1-800-242-0607 (货号 # ALI4404) Jackson实验室电话为: 1-800-367-5296 (货号 # 111-036-045)。
A ABST底物在4°C能保持多久? 在冰箱中通常一个月内可以保持稳定。如果保存更长的时间试剂可能会变绿，并且出现高背景。ABST溶液在实验中应该差不多是无色的。其他溶液也应如此。所有溶液在4°C保存时间通常不超过1个月，并不含硫柳汞。
A 在加入过敏原溶液之前用1%BSA/PBS-T封闭板子30分钟。
A在某些情况下，出现高背景或在系列稀释时，最初的几个样本稀释得太低或检测不到，却出现随机样本检测值高，可能是由于洗板机的污染。洗板机应当定期清洗预防一些随即孔污染和堵塞。
A 如果手动洗板，实验时增加清洗的次数会有助于降低背景。将各孔完全填满不要溢出，然后小心的将板倾倒不要污染。然后在纸巾上温和的轻敲以去除剩余缓冲液。
Q4 我们重复的标准曲线和/或样品测试结果有很高的CV值，这是什么原因?
A 加入ABST后，读数确认显色值之前，要自始至终时常通过轻打板子两侧来温和摇晃。
A在进行ELISA实验室洗液是非常重要的。确认移液器特别是多孔道的在整块板倍比稀释时每个孔吸取和排出的量都一样。并且确认在移液时没有气泡。
Q5 我们可以保存微孔中包被的抗体吗？他们能被保存多久，我们应该怎样保存？
A包被过的板子只能保存很短的一段时间，如一个周末，或长至1周。我们通常将用抗体溶液包被的板子用塑料薄膜抱住放入实验室冰箱中或冷室中。我们未尝试过更长的保存时间。
Q6 我们可以用OPD货TMB来代替ABST吗，按照Sigma的要求（放在干燥器中，含氩）保存ABST有些困难。
A 您可以用OPD或TMB。我们不将ABST保存在氩中（这个不是很必要），同样得到了好的结果。
Q7 灰尘样本应该保存在 4°C吗，或是要冷冻？
A 实验前我们通常将房屋灰尘样本保存在4°C，但一定提取过后应保存在-20°C。
Q8在ELISA中我如何终止酶反应?
A终止反应可以在每个孔内加入0.1ml 0.002M 叠氮化钠。大部分ELISA读板机扫描板子的时间在5-20秒内，若未终止反应，OD值应达到。如果有大量的板子（5-10个板子）需要处理，或因其他原因如拍照需要保存时，可以加入叠氮化合物。
Q9 ELISA孵育的温度是多少?
A用捕获抗体包被ELISA板的温度为4°C过夜.其他所有步骤都在室温下进行，通常为20-25°C。
Q10 一个ELISA试剂盒可以分析多少灰尘或空气样本？你们推荐分享多少？
A Indoor的ELISA试剂盒对10份或20份的96孔板来说包含足够的试剂(捕获mAb, 生物素化的检测mAb，的过敏原标准品)，每块板子可以分析的样品数量取决于每个样本的稀释数量
A 重复的标准曲线需要4个对照孔(PBS-T)，占用24个孔，每个板剩余的72个孔检测样本。一般每个灰尘样本我们倍比稀释4个（螨过敏原1/10, 1/20, 1/40, 1/80），这意味着每块板可以检测18个样本。在这样的条件下一个20块板的ELISA试剂盒可以分析18 x 20 = 360个样本。
每个样本我们稀释四种，这样在大多数情况下，在一个单一实验中我们可以达到就>90%的检测结果。四个稀释度会增加每个样本控制曲线线性部分至少有两个点的可能性。，果样本已知过敏原水平范围，也可以用较少的稀释梯度。其他样本，如过敏原提取物，可能含有非常高的过敏原水平，那么在倍比稀释时，需要增加稀释的倍数，从1/100 或 1/1000开始,并可能需要在整个ELISA板上作梯度稀释。
空气样本通常过敏原水平较低，实验时可以以1/2, 1/4, 1/8, 和1/16来稀释。
Q补充为什么没有单独检测Der p 2的ELISA试剂盒呢？
A由于Der p 2和Der f 2为相同抗原表位，所以使用的检测抗体无法区分这两种物质。我们有试剂盒EL-D2就是检测Der p 2和Der f 2过敏原的
Environmental Testing
Q1我想给Indoor邮寄一些样本做过敏原分析，你们需要多少量?
A 分析大量灰尘样本的过敏原水平，我们需要100mg优质的灰尘。我们近期的研究发现由于差异的可能性增加，除非至少有10mg优质的灰尘样品可用否则不能做过敏原分析。少于10mg可用优质灰尘不能做分析，会被邮寄退回（NES-不足量样本）
A 如果用DUSTREAM™ 并在推荐的地区和时间采样也只有很少或没有灰尘，那么持续采样直到滤器达到1/4满。我们的过敏原结果不是基于地区的，而是基于每克灰尘中有多少微克过敏原。
A对于过敏原提取物，或大量灰尘、空气过滤器中的的过敏原提取物，我们需要最少0.5ml，特别是当要检测多个过敏原时。
A 对于空气采样录音带，整个过滤器要用1mlPBS提取溶液来提取，每个过滤器的结果据报道为ng或µg 级。
Q2我想给Indoor邮寄一些样本做内毒素分析，你们需要多少量
A分析大量灰尘样本的内毒素水平，我们需要100mg优质的灰尘。如果少于20mg优质灰尘是无法做大量灰尘的分析的。如果用DUSTREAM™ 并在推荐的地区和时间采样也只有很少或没有灰尘，那么持续采样直到滤器达到1/4满。我们的内毒素结果不是基于地区的，而是基于每克灰尘中的内毒素单位。
A 我们收取的样本是要为提取过的，这点非常重要。提取的过程必须在一个干净的环境中进行，并且要用含0.05%吐温不含内毒素的水。样本的提取和分析应在同一天进行。这些步骤对于防止其他来源的内毒素污染非常重要。
A 空气过滤器样品也可邮来做内毒素分析。整个过滤器在1ml无内毒素含0.05%吐温的水中提取。结果报告形式为每个过滤器中含有多少内毒素单位。我们推荐同时邮寄一个空的过滤器检测作为使用后过滤器的基准。
Q3我在我的实验室中准备要分析的灰尘样本，我需要过滤这些灰尘吗？
A 是否过滤灰尘是由该灰尘的质量决定的。我们通常不过滤从床上和柔软的家具上收集的灰尘。地毯样本过滤（如用No.45，直径355um的筛子过滤）来分离纤维和优质灰尘中的大颗粒。我们推荐用DUSTREAM™收集器，可以大大减少过滤灰尘的需要。用DUSTREAM™收集器收集灰尘样本后，拆下含有灰尘样本的尼龙滤器，倒置滤器，轻拍，是灰尘落入一张称过重的纸上，优质灰尘会比纤维先从过滤器中出来。
Q4 灰尘样本和其提取物应该怎样保存？
A灰尘样本提取前应在室温下，保存在干燥的地方。灰尘提取物应在-20℃冰箱中冷冻保存。
Q5INDOOR分析服务的采样和委托程序是怎样的？
Q6你推荐用什么方法准备过敏原分析的灰尘提取物 ?
A用于内毒素实验的提取物需要在Indoor分析服务实验室中进行，同天进行分析，以防内毒素污染等多重风险。这项服务不应邮寄提取物，只要干的样本如大量灰尘和空气过滤器。
推荐仪器
