前期准备工作的意义
• 目的：是为临床提供准确可靠的实验诊断依据。
• 为了保证实验数据的可靠性，在检验医学中必须坚持全面质量控制（total quality control，TQC ）. 对影响临床检验结果可靠性的各方面因素及各个环节进行质量控制
• 全过程质量控制包括实验前（分析前）、实验中（分析中）和实验后（分析后）三个阶段的质量控制。在实验误差中实验前误差占70%，因而实验前质量保证对减少实验误差显得尤其重要。
实验前期准备工作

• 样品的收集和采集
• 送检单的填写
• 样品的登记
• 待检样本的分离和保存
• 试剂的准备

样品登记表
• 规范的样品的登记应记录详细，包括样品的个人信息，病史，以往检测结果的记录等。
• 样品登记包括送检单位、患者姓名、性别、年龄、职业、人群类别、家庭地址、收样日期、收样人姓名以及标本状态和检测的结果
• 样品的登记表
标本的采集工作

• 使用一次性真空采血管（一管一针），按照采血管规格采集，通常采血量以采血管规格60％~80%为宜，但要保证拥有足够的标本量用于ELISA实验检测。
• 真空采管大致分为：
　1肝素纳　　　　　　　　　　　　　　　
　2肝素理　　　　　　　　　　　　
　3促凝管　　　　　　　　　　　　　　　　　
　4血沉管　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　5 PT管　　
　6血常规管　
　7分离胶／促凝剂
　8EDTA-K2，K3，Na2
标本的采集工作
• 采集血样后首先做好标本的标识，使用条形码是最快捷简便的方法，送检单和标本都贴上相对应的条形码可以避免出错。

样品送检单
• 以《全国艾滋病检测技术规范2004年版》为标准，内容包括：
• 送检单位；
• 姓名；
• 年龄；
• 性别；
• 送检人群；
• 职业；
• 地址；
• 筛查结果；                                  送检单的填写

血清标本的分离
• 标本离心前一般自行凝集，通常放置于室温（22～25℃）30～60 min 血液标本可自发完全凝集；
• 使用离心机时应注意平衡和避免液体飞溅，必须等离心机停止工作后才可打开盖板以免发生意外。
血清标本的分离
• 选择适合的离心冻存管和冻存盒保存血清标本，血清冻存管规格要求：
• 1、2ML   
• 2、带螺口   
• 3、带内密封圈

溶血
• 红细胞破裂，血红蛋白逸出称红细胞溶解，简称溶血。
• 可由多种理化因素和毒素引起。
• 在体外，如低渗溶液、机械性强力的振荡、突然低温都可引发。

如何避免溶血
• 要注意避免出现严重溶血。我们建议样品采集2小时内分离出血清，原因是血红蛋白中含有血红素基团，有类似过氧化物的活性，因此在以标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应显色，容易造成假阳性反应。

移液器的维护和保养
• 每次实验完毕后可用75%的酒精棉球来擦拭，然后用双蒸水将移液器下半部分拆卸清洗、晾干以备下次使用。
血清标本的保存
• 血清标本如是以无菌操作分离（使用灭菌后的枪头和冻存管），则可以在2～8℃下保存一周，如果为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-40℃以下。

血清标本保存
  一、样本的采集及血清分离中要注意尽量    避免细菌污染，长时间存放的标本会导致一些细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；例如一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。所以在不再进行重复实验时应把标本放置于冷冻保存。
血清标本的保存
• 二、冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。
• 三、标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。

血清标本的保存需要注意的问题
• 标本要有详细的标识以备查询（包括样品受理号、患者姓名）

• 冰箱和超低温冰箱的温度记录表

• 使用冷冻标签纸填写样品标识

试剂准备
• 在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用，而忽略了这种做法有可能影响后面温育时间不够的问题，其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是，在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中拿出来在室温下放置20分钟以上后，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。
试剂准备
• 其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。此外，底物溶液应在反应显色前临时配制。

HIV抗体检测实验
• 对于我们常用的ELISA实验大致可以分为以下几个步骤：
1、加样
2、温育
3、加酶标抗体
4、加底物液显色 
5、终止反应
6、结果判定 

加血清样品的注意事项
• 血清样本的加入要使用微量加样器。使用微量加样器加样必须注意的关键点是：
• 1 加样不可太快：加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。
• 2 要避免加在孔壁上部：加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。
• 3 不允许溅出和产生气泡：溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异
加血清样品的注意事项
• 4 加样移液器不能混合使用：不可用加血液样品的移液器和加试剂用的移液器混用：
• 5 加入的样品量要精准：选择合格厂家生产的移液器，查看产品校准证书记录，认可的实验室每半年都要做自校准记录

移液器的使用
• 垂直加样
• 吸头尖端需浸入液面3mm以下
• 慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度
• 放液时吸头尖端靠在容器内壁

移液器的使用
• 反向吸液：
• 适用于粘稠液体和易挥发的液体
• 多吸入的液体可疑补偿吸头内部的表面吸附，因此定量实验都采用此方法
温育

• 温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。

温育

• 温育这一步是临床ELISA测定中最容易出现问题的步骤。通常目前国内ELISA商品试剂盒的反应温育时间为37℃ 30分钟～1小时，进口ELISA试剂盒则通常为37℃ 1～2小时才能有较完全的结合，低于试剂盒所要求的时间，就可能会影响测定的下限。因此，关于温育，要保证在设定的温度下有足够的反应时间。

洗涤
• 洗涤的方式分为机洗和手洗，现在实验室由于都配备了洗板机已基本取代了手工操作，洗涤的过程大致分为两种模式：
     （1）浸泡式  常用于全自动洗涤仪器实验中，浸泡时间约为30-60秒
  （2）流水冲洗式   洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速，但也有缺点。

 洗涤
• 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按照试剂盒厂家要求来洗涤

显色和比色
    显色：ELISA试剂的显色液在使用前需要制备，如果没有用完的显色液切不可重复使用
    比色：加入显色剂以后应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架中。
    比色结果以光密度（oplical density，OD）表达， Co=cut off 临界值 ，根据试剂盒说明书设定计算公式。S=sample 样本值，也就是测出来的值。

比色
• 单波长测定就是选择一个测定波长,直接测定样本的吸光度
• 双波长测量是采用两个不同的波长,即测定波长(又叫主波长)和参比波长(又叫次波长)同时测定样品的吸光度,以消除一些外在影响因素,提高测定结果的精密度和准确度
• 可根据试剂盒说明书的要求进行选择合适的波长进行测定

酶标比色仪
      酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。许多试剂公司配套供应酶标仪。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定

实验有效性

• 比色时应严格按照试剂盒说明书进行操作，每次比色都要设置实验有效性才可进行测定，对不符合有效性的实验进行重复检测！

• 现举例某厂家生产的ELISA试剂检测HIV的为例。试剂盒中的阴性对照品为每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得NC值后，先计算阴性对照值的平均数（NCX）和阳性对照值的平均数（PCX），两个平均数的差（P-N）必须大于一个特定的数值（例0.500），试验才有效。3个阴性对照值均应≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX；如有两个阴性对照值超出以上范围，则该次实验无效。

判读结果
• 阳性判定值（cut-off ）一般为阴性对照均值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。
用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。
• 阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。
ELISA试验受诸多因素影响
。其中试剂盒的质量以及操作者的水平将直接影响到这一过程的成功与否。因此在完全按照试剂盒要求的前提下，均一，稳定的操作过程和试验条件是获得最佳试验结果的必要条件。
   
质控
    外部对照质控血清是为了监控检测的重复性和稳定性以及试剂盒批间或孔间差异而由实验室设置的一套对照血清，包括强阳性、弱阳性和阴性对照血清。也可以只设置一个弱阳性对照，以该试剂盒临界值（Cut off）的2～3倍为宜。
质控
   HIV抗体检测实验每次实验都要设置外部对照。制备方法:  按一年使用量配置，取HIV抗体阴性血清和阳性血清，56℃ 30分钟灭活，3000r/分离心15分钟，经梯度稀释后用0.2um滤膜
   过滤除菌。可参见《全国艾滋病检测技术规范2004》第41页

ELISA实验的自身防护
• HIV-ELISA实验尽量使用一次性塑胶实验器材，由于玻璃器皿容易造成划伤，建议不要使用。
• 加样及分离标本时应在生物安全柜内操作，如没有配备生物安全柜的实验室，实验人员操作时可以带口罩和防护眼镜进行个人防护。
• 实验做完应及时将标本做高压消毒处理。
规范的实验记录
    每次做完实验一定要做好实验的记录，对来样的登记要详细规范,实验记录尽量使用A4纸保存,有条件的实验室也可保存电子档案以便于查询,对于筛查实验室所使用的记录表格包括样品登记，试验原始记录，样品送检单，以及筛查报告等都要妥善保存。仪器试用记录和消毒灭菌记录要填写完整。
  

• 一    ELISA实验记录
• 二    ELISA实验结果（见打印）
• 三    确证实验记录
• 四    仪器使用记录本
• 五    标本销毁记录
• 六    温度记录表
ELISA实验记录表内容

1、样品数量：
2、标本类型：
3、使用试剂：
4、生产厂家：
5、有 效 期：                        
6、批    号：
7、室    温：
ELISA实验记录表内容
8、  检测项目：HIV抗体检测      
9、  检测依据：《全国艾滋病检测技术规范》2004 版
10、使用设备：酶标仪、洗板机、培养箱、移液器、
                                 生物安全柜
11、实验条件：孵育温度、测量波长、参考波长 /    nm                      
12、试剂配制：洗涤液

仪器使用登记本
• 使用的时间
• 工作时间
• 工作环境
• 测定项目
• 检测数量
• 仪器状况
• 使用者和校准人签名

抗原或抗体检测的方法

于各种检测方法中所用的抗原性状不同，出现结果的现象也不同。最广泛应用方法有下述几种：

　　（一）沉淀反应

　　可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物。在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应（precipitation neaction）。

　　1．环状沉淀试验　　先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径小于0.5cm的小试管底部。将稀释的含有可溶性抗原的材料重叠于上，让抗原与抗体在两液体的界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验（ring precipitationtest）,此法简便易行，需用材料较多是其缺点。

　　2．单向免疫扩散试验　　单向免疫扩散试验（single immunodiffusion）是在凝胶中进行的沉淀反应。将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增加到一定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正相关。本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度（最低浓度）约为10～20μg/ml，常用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺点是需1～2天才能看结果（图20-1）

图20-1 单向免疫扩散试验示意图

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