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新型乳酸固定化酶荧光毛细生物传感器

2009年05月20日 13:32:12 Wednesday

作者：李永生 鞠香 高秀峰* 杨微 作者单位：四川大学化学工程学院，四川大学基础医学与法医学院

【摘要】  　　对长45 mm、内径0.9 mm的医用毛细管进行γ氨丙基三乙氧基硅烷氨基化和戊二醛醛基化后，再将乳酸脱氢酶(LDH)的氨基与戊二醛的醛基结合，使其固定在毛细管内壁，构成一种新型固定化酶乳酸荧光毛细生物传感器(IELFCBS)，实现了对乳酸的微量、快速测定。IELFCBS吸入辅酶Ⅰ与乳酸的混合液，在固定化酶催化下使乳酸与辅酶Ⅰ反应，生成荧光物质还原型辅酶Ⅰ；激发波长353 nm、发射波长466 nm。适用于IELFCBS的优化条件为：辅酶Ⅰ浓度4 mmol/L、用于固定化的LDH浓度60 kU/L、反应时间15 min、反应温度38 ℃、测定范围为1.0～5.0 mmol/L、回收率95%～98%，IELFCBS的相对标准偏差为RSD<1.5%(n=11)，检出限为0.45 mmol/L。IELFCBS的试液用量极少(18 μL)，并能重复使用，可望用于发酵食品、药品、血液标本等各类样品中乳酸的快速检测。

【关键词】  固定化酶 荧光毛细分析 还原型辅酶Ⅰ 乳酸 生物传感器

引言

乳酸在机体内所有组织中都可产生，是体内糖无氧酵解的最终产物。乳酸中毒是代谢性酸中毒最常见的类型之一，表现为血中乳酸值增高，例如贫血、白血病、心肌梗塞、急性肝萎缩、糖尿病等的血浆乳酸值升高。生物样品中乳酸的测定对这些疾病的诊断具有重要的参考价值[1]。乳酸也是酒中一种重要的有机酸。在浓香型白酒中，它的含量仅次于己酸。其含量的多少，不但对白酒的口味和后味有较大影响，而且也直接反映了酒醅在发展过程中是否正常。因此，测定白酒中乳酸的含量对酿酒业有重要意义[2，3]。此外，在运动医学中，合理地安排运动量及评价运动员无氧代谢和有氧代谢能力时，也需要一种能够快速、准确测定血乳酸盐的特殊手段[4]。
    目前，国内外各种样品中乳酸含量测定方法有气相色谱法(GC) [5]、高效液相色谱法(HPLC) [6，7]、酶法[8，9]、酶传感器法[10～12]、荧光法[13～15]及流动注射分析法(FIA) [16，17]等。其中酶法和酶电极法操作简单、分析速度快、选择性好、灵敏度高，使用较为广泛，但酶的用量大、成本高；HPLC、GC法存在单个样品分析时间长，色谱柱易污染，不便携带，不适合现场的快速检测等缺点；固定化酶FIA法，具有快速、简便、酶利用率高的特点；常规的荧光光度法灵敏度虽高，选择性好，但目前应用不广泛。
    荧光毛细分析法(FCA) [18]，用一个专用支架和常规医用毛细管替代传统的荧光池，毛细管既是被测液容器、反应容器,又是酶、基因探针或试剂的固定化载体。FCA真正实现了微量样品的微量分析，大大减少排废污染，使荧光光度法更加实用化、普及化。基于FCA法已成功测定了酒中乙醇[19]、血清中丙酮酸[20]、尿中磺酸化胆汁酸[21]、靶核苷酸[22]等，本研究基于FCA和固定化酶技术，研制了一种测定乳酸的毛细生物传感器(immobilization enzyme lactate fluorescence capillary biosensor, IELFCBS)。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂
    F4500荧光分光光度仪(日本日立公司)、AUW120D电子天平（日本岛津公司）、PXJ1C+离子活度计（成都世纪方舟科技有限公司）；毛细管定位座（自制）。18 μL玻璃毛细管（华西医科大学仪器厂）。
    所用的酶试剂有氧化型辅酶Ⅰ(nicotinamideadenine dinucleotid，NAD+)； 还原型辅酶Ⅰ(reduced form of nicotinamideadenine dinucleotid，NADH)(日本酵母工业株式会社)； 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH，5 kU/94 mg， Sigam公司)；JHA110硅烷偶联剂(98%, 荆州市江汉精细化工)； 戊二醛(重庆北培化学试剂)、乳酸(成都科莱公司)。所用试剂均为分析纯。本实验用水均为超纯水（0.065 μS/cm）。
   
　　0.1 mol/L磷酸缓冲液(PBS)：取100 mL 0.1 mol/L Na2HPO4溶液，用0.1 mol/L KH2PO4溶液调pH到7.5，室温保存；0.1 mol/L TrisHCl缓冲液：准确称取6.055 g Tris碱，溶于430～440 mL去离子水中，边搅拌边加NH4Cl，调节至实验所需pH值，然后加水定容至500 mL，室温保存；2.5%戊二醛溶液：量取2.5 mL戊二醛(50%，Ｖ/Ｖ)，移入50 mL容量瓶中用水定容，摇匀后倒入试剂瓶，常温下保存；50 mmol/L乳酸储备液：称取0.125 g乳酸(85%～90％)，用Tris盐酸缓冲液（pH 8.8）定容至25 mL；100 kU/L LDH母液：准确称取2.0 mg LDH(5 kU／９４ mg)，使用Tris盐酸缓冲液（pH 8.8）稀释至1.0 mL；10 mmol/L NAD+ 母液：准确称取6.6 mg NAD+, 用TrisHCl缓冲液（pH 8.8）定容至1.0 mL。4%(Ｖ/Ｖ) γ氨丙基三乙氧基硅烷溶液配制：取1.0 mL γ氨丙基三乙氧基硅烷溶液（98%）于25 mL容量瓶中，用正己烷稀释定容。

　　2.2  酶的固定化及测定过程
   
　　酶固定化前，用2 mol/L NaOH的乙醇溶液清洗毛细管的内外管壁，再用超纯水清洗，最后放入隔水式电热恒温培养箱在40 ℃下烘干待用。
   
　　将预处理好的毛细管，在一定温度下用JHA110溶液浸泡数小时；再用PBS缓冲液(pH 7.0)冲洗，完成毛细管氨基化；在真空状态下，用2.5%戊二醛浸泡氨基化毛细管1 h(戊二醛容易被氧化); 再用PBS 缓冲液(pH 7.0)洗除未结合的游离戊二醛, 完成毛细管醛基化；毛细管吸入PBS缓冲液配制的LDH溶液，静置过夜(12 h), 毛细管壁上的戊二醛醛基与LDH的氨基结合，构成IELFCBS。将IELCBS用PBS缓冲液(pH 7.0)冲洗，再用TrisHCl缓冲液(pH 7.0)浸泡1 h左右，封闭IELFCBS上多余的醛基, 最后将其保存在PBS缓冲液(pH 7.0)中。
 
　　图1  用IELFCBS测定乳酸的示意图（略）

　　Fig.1  Illustration of immobilization enzyme lactate fluorescence capillary biosensor(IELFCBS) for the determination of lactate

　　S． 样品(sample); 1． 荧光反应液(fluorescence reaction solution); 2． 固定化酶乳酸生物传感器(IELFCBS); 3． 毛细管壁(capillary wall); 4． 硅烷偶联剂; 5． 1,5戊二醛(glutaraldehyde); 6． 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH); 7． 反应混合液(reaction mixture solution)。   

　　2.3  测定原理及过程
   
　　在LDH的催化作用下，乳酸和NAD+反应生成丙酮酸和荧光物质NADH，通过检测NADH的荧光强度来间接定量乳酸。
   
　　IELFCBS的使用过程如图1所示。在两个1.5 mL EP管中，分别加入40 μL NAD+溶液、0和50 μL乳酸标准液，最后再分别加入TrisHCl缓冲液，使其总体积达到100 μL。在EP管中混合均匀后，将荧光反应混合液吸入IELFCBS中；IELFCBS两端用橡胶帽堵住，再放入小试管内，在38 ℃水浴中反应15 min后，将IELFCBS插入毛细管定位座中，在荧光仪上测定其荧光强度。其中，不含乳酸标准液的荧光强度为试剂空白(F 1)，含乳酸标准液的反应混合液荧光强度为测定值(F2)，用ΔF=F2－F 1定量乳酸浓度。
   
　　从测定原理可知，NADH是测定乳酸过程中的重要环节。所以，对NADH的波长进行了扫描。在室温下用400 mg/L NADH溶液作为试样吸入毛细管，在荧光仪上进行测定。结果表明，NADH的最大激发和发射波长分别为353 nm和466 nm。
   
　　随后，用FCA法对同一系列不同浓度的NADH标准液进行测定。由实验结果可知，NADH浓度在0～90 mg/L范围内与荧光强度有良好的线性关系，ΔF=0.159CNADH－0.2862, r=0.9976。

　　3  结果与讨论

　　3.1  氨基化试剂浓度及LDH固定化浓度对荧光强度的影响
   
　　先将乳酸/LDH/NAD+体系的反应条件固定为：反应时间15 min, 反应温度38 ℃，NAD+浓度4 mmol/L，TrisHCl缓冲液(pH 8.8)。以1 mmol/L和2 mmol/L的乳酸标准液为被测样品，分别用1%、2%、4%、10%、20%和40%(Ｖ/Ｖ, 正己烷稀释)的JHA110进行毛细管氨基化后，制作成6个IELCBS，并分别吸入乳酸标准液进行荧光测定。结果表明，当JHA110浓度为4％时，IELCBS的荧光强度达到最大值。因此，用于固定化的JHA110浓度选为4％。 

　　图２  用于固定化的ＬＤＨ浓度对荧光强度的影响（略）

　　Ｆig.2  Effect of LDH concentration used for immobilization on fluorescence intensity

　　1. lactate 1.0 mmol/L; 2. lactate 2.0 mmol/L.
   
　　LDH作为乳酸/NAD+氧化还原反应体系的催化剂，其用量的多少对催化反应有一定的影响。所以，对LDH的固定化浓度进行了优选。除JHA110浓度为4％外，其它实验条件及操作过程同3.1。先用不同浓度的LDH（5、10、20、40、60和80 kU/L）制成6个IELFCBS，再用这些IELFCBS分别吸入含乳酸标准液的相同反应混合液，测定其荧光强度。从图2可见，当LDH浓度小于60 kU/L时，IELFCBS的荧光强度随LDH浓度的增加而增加；当LDH浓度超过60 kU/L时，IELFCBS的荧光强度不再发生变化。因此，实验选择固定化的LDH浓度为60 kU/L。

　　3.2  NAD+浓度及反应体系酸度对荧光强度的影响
   
　　除用于IELFCBS固定化的LDH浓度为60 kU/L外，其它实验条件同3.1。分别改变IELFCBS中乳酸/固定化LDH/NAD+反应体系的NAD+浓度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mmol/L），其荧光强度随NAD+浓度提高而缓慢增大，NAD+浓度为4.0 mmol/L时，荧光强度最大。因此，NAD+浓度选为4.0 mmol/L。
   
　　NAD+浓度设定为4.0 mmol/L，用不同pH值的TrisHCl缓冲液配制反应混合液，测定IELFCBS中反应混合液的荧光强度，间接地考察了pH对固定化酶催化反应体系的影响。结果见图３。当反应体系的pH值为8.8时其荧光强度达到最大值；当pH>8.8，其荧光强度值有所降低。所以，反应混合液的pH值定为8.8。

　　3.3  反应时间和温度对荧光强度的影响
   
　　在不同的反应时间（0、5、10、15、20、30和40 min），测定IELFCBS中反应混合液的荧光强度值。从图4可知，当反应体系的反应时间在15～20 min时，荧光强度较大；当反应时间超过20 min后，反应体系的荧光强度随时间的增加不再有变化。所以，考虑到尽量缩短测定时间，本实验将反应时间选为15 min。
     
　　图3  反应混合液酸度对荧光强度的影响（略）

　　Fig.3  Effect of acidity of mixed solution on fluorescence intensity

　　1. 1.0 mmol/L lactate; 2. 2.0 mmol/L lactate. 

　　图4  反应时间对荧光强度的影响（略）

　　Fig.4  Effect of reaction time on fluorescence intensity(LDH: 60 kU/L)

　　1. 1.0 mmol/L lactate; 2. 2.0 mmol/L lactate.

　　通过测定不同温度下IELCBS中反应混合液的荧光强度，考察了反应温度对反应体系的影响。除反应时间为15 min外，其它实验条件同上。得到的结果表明，在38 ℃时，IELFCBS中的荧光强度达到最大值；当超过38 ℃时，荧光强度开始降低。温度升高虽能使酶的活力增大,使酶促反应速度加快；但温度过高时,由于酶蛋白的热变性致使酶逐渐失活,使反应速度反而下降，导致荧光强度降低。因而，本实验的反应温度选用38 ℃。

　　3.4  LDH的状态对乳酸测定的影响
   
　　为了考察在液态和固定化状态下LDH的催化效果，本实验基于IELCBS和液态酶FCA法，分别对一系列不同浓度(0.5、1、1.5和2 mmol/L)的乳酸标准液的荧光强度进行了测定。实验条件：IELCBS中的 LDH的固定化浓度为60 kU/L；液态酶FCA法中使用的LDH浓度也是60 kU/L；NAD+浓度均为4.0 mmol/L。得到的IELFCBS和液态酶FCA法的乳酸标准曲线的线性方程分别为：ΔF(IELFCBS) = 4.7093C乳酸 －0.0842(r=0.9993)和ΔF(液态酶FCA)=3.086C乳酸 +0.19(r=0.9951)。从方程的斜率可以看出，IELFCBS测定乳酸时，其灵敏度大于液态酶FCA法。

　　3.5  IELFCBS储存稳定性考察
   
　　将IELFCBS中用于固定化的LDH浓度定为60 kU/L，考察了IELFCBS的稳定性。IELFCBS的稳定性指标用“酶活性比”表示。将刚制成的IELFCBS的酶活性比设为100%，储存不同时间的IELFCBS酶活性比按IELFCBS酶活性比=F′/Fo计算。其中，Fo为刚制成的IELCBS的荧光强度；F′为储存不同时间的IELFCBS荧光强度。 

　　图５  ＩＥＬＢＣＳ的稳定性实验（略）

　　Fig.5  Stability test of IELBCS

　　1. 1.0 mmol/L lactate； 2. 2.0 mmol/L lactate.
   
　　同时制作10个IELFCBS，保存在4 ℃下的PBS缓冲液(pH 7.0)中。然后分别在不同的时间测定这些IELFCBS的荧光强度值，结果如图5所示。随着IELFCBS储存时间的延长，其荧光强度呈逐渐减弱，到30 d时，IELFCBS中的LDH活性比衰减约50％。

　　3.6  标准样品和实际样品测定
   
　　综上可知，适合于IELCBS的优化条件是：激发波长350 nm，发射波长460 nm，入射光和出射光的光谱带宽分别为10 nm和20 nm; 用于固定化的JHA110浓度为4%、LDH浓度为60 kU/L，NAD+浓度为4.0 mmol/L，反应时间为15 min，反应温度为38 ℃。在优化的实验条件下，用IELFCBS 分别测定了不同浓度的乳酸标准液。在1.0～5.0 mmol/L内, 其线性相关方程为ΔF=30.931C乳酸－1.6202(r=0.9930)。
   
　　由于酸奶成分复杂，可能存在着一些对乳酸/LDH/NAD+反应体系有干扰的物质。为了预先消除这些干扰，首先对酸奶样品的预孵温度和时间进行了考察。在酸奶样品中不加LDH，只按比例加入NAD+/TrisHCl混合液，固定反应时间为15 min，改变反应体系温度(25、38、60、80、90和100 ℃)，观察荧光强度的变化。结果发现，当温度达到80 ℃时，体系荧光强度趋于恒定；然后，在此温度下改变反应时间(0、4、10、20、25和30 min)，观察其荧光强度的变化。结果表明，当达到10 min后，反应体系的荧光强度趋于恒定，所以酸奶样品的预孵时间和温度选定为10 min和80 ℃。
   
　　用IELFCBS对3种市售酸奶中的乳酸含量进行了测定。测定前将酸奶预孵，然后以2000 r/min转速离心30 min，取上层清液作为试样母液。实际测定时，对母液将按不同的比例稀释。各种酸奶中乳酸含量的测定结果见表1。

　　表1  用IELFCBS对酸奶中乳酸含量的测定结果（略）

　　Table 1  Determination of lactate concentration in madzoons by IELCBS

　　F1: 试剂空白的荧光（fluorecence of blank）; F2: 样品液荧光(fluorecence of sample); ΔＦ＝Ｆ２－Ｆ１。

　　3.7  回收率测定和对比实验
   
　　为了检验IELFCBS的准确性，在乳饮料试样中分别添加不同乳酸标准液，配成高、中、低3个浓度，进行了回收率的测定。由表2可以看出，样品的添加回收率在95%～98%之间，结果令人满意。另外，用商品化的乳酸/LDH/NAD+/PMS/NBT比色测试盒(南京建成生物工程研究所），对上述的酸奶样品中乳酸含量进行测定，发现两种方法测定结果一致（r=0.996）。这证明IELCBS 可靠，能用于乳酸的定量分析。
   
　　为了考察IELFCBS的精密度，在乳酸浓度的线性范围内，分别对2.0 mmol/L(: 352.7; 标准偏差: 4.62)和5.0 mmol/L(: 473.1; 标准偏差: 3.90)的乳酸标准液重复测定11次。结果表明，IELFCBS的相对标准偏差（RSD）在0.83%～1.31%范围内，即其精密度已满足测定需要。以３倍标准偏差计算IELFCBS 的检出限为0.45 mmol/L。

　　表2  回收率测定（略）

　　Table 2  Determination of recovery

　　研究结果表明，建立的毛细管生物传感器方法，实现了乳酸脱氢酶循环使用，达到节约贵重的酶试剂，降低实验成本，便于携带，利于普及推广的目的。

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