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牛结核γ-干扰素
全血培养试验操作规程
SOP序号：REAL-010
编制人员：曹瑞
青岛瑞尔生物技术有限公司
2014-01-01
牛结核γ-干扰素全血培养试验操作规程
1. 简介
1.1 适用范围
本试验为牛结核γ-干扰素ELISA检测试验的前期试验，用牛型和禽型
结核菌素（PPD）刺激牛全血，获得培养上清。
应用于《牛结核γ-干扰素ELISA检测试剂盒》，目的是检测上清中的γ-干扰素，从而判断牛结核的感染情况。
1.2 试验背景
牛γ-干扰素试验是以刺激培养全血为基础，检测牛结核病的一种试验方法。通常，感染分支杆菌的牛，其血液中的淋巴细胞能识别特异的分支杆菌抗原（包括结核菌素PPD），淋巴细胞识别分支杆菌抗原的过程涉及细胞因子的产生和释放，γ-干扰素就是其中最重要的一种。用结核菌素(PPD)刺激培养牛全血，全血中的T淋巴细胞就会识别PPD，发生细胞免疫反应，其中一个直接的表现就是产生并释放γ-干扰素。γ-干扰素可用γ-干扰素特异的单克隆抗体夹心法检测。
2. 安全性
2.1 所有操作步骤都应符合当地的“危险物质控制规范”
2.2 此试验存在一定风险，尽管风险比较小。阳性反应的全血可能会含有分枝杆菌，因此所有操作步骤都应遵循下面的操作规程。
3. 材料
3.1 试剂
牛PPD、禽PPD，PBS，用前混匀。
3.2 试验耗材
5ml肝素采血管（无菌）、24孔平底细胞培养板（无菌）、1ml与200µl吸头（无菌）、1.5ml Ep管、生物安全口罩、高压灭菌袋、乳胶手套、消毒剂、记号笔。
3.3 仪器设备
单道移液器（0-1000µl，0-200µl）、8-12多道移液器、CO2培养箱（37°C，5%CO2）。
4. 操作程序
4.1 注意事项
4.1.1 处理抗原和全血需在二级生物安全实验室。无菌操作，保证刺激抗原和相关试剂无菌，无污染。二级生物安全实验室可保护实验者处理全血时的安全。
4.1.2 样品接收
并非所有的全血样品都可以用于试验，当样品出现下列情况时，样品视为不合格，应当进行无害化处理。
（1）使用不当真空管采血，如EDTA真空采血管。只有肝素抗凝采血管适用。
（2）冷冻或长时间冷藏的全血样品。全血样品应当保存在合适的温度（16-37°C）。
（3）无标记的样品。
（4）采血管破损的样品。
（5）储存时间超过8小时的样品。
（6）出现凝血的样品（少量凝血可以）。
（7）血量少于5ml的样品。
4.2 全血采集及培养
4.2.1采血
无菌采集至少5ml血液放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。室温（22±5℃，避免温度过高或过低）下运送到实验室并在采血后24个小时内进行培养。避免血液冷冻和冷藏。
4.2.2血液分装
分装前轻轻颠倒试管，充分混匀血液样品。由于本试验需要活的淋巴细胞，因此需要将细胞损伤降至最低。将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加三管1.5mL分装的抗凝血（见表1）。无菌条件下进行操作。
表1 吸取血液或抗原至24孔培养板的推荐操作
|
1号动物 |
BoPPD 1 |
AvPPD 1 |
PBS 1 |
BoPPD 2 |
AvPPD 2 |
PBS 2 |
2号动物 |
|
3号动物 |
BoPPD 3 |
AvPPD 3 |
PBS 3 |
BoPPD 4 |
AvPPD 4 |
PBS 4 |
4号动物 |
|
5号动物 |
BoPPD 5 |
AvPPD 5 |
PBS 5 |
BoPPD 6 |
AvPPD 6 |
PBS 6 |
6号动物 |
|
7号动物 |
BoPPD 7 |
AvPPD 7 |
PBS 7 |
BoPPD 8 |
AvPPD 8 |
PBS 8 |
8号动物 |
PBS=阴性对照抗原（PBS）；AvPPD＝禽型结核菌素；BoPPD＝牛型结核菌素
4.2.3加入刺激抗原
无菌加入100µL PBS(阴性抗原对照)，禽PPD或牛PPD至相应的孔。抗原
必须与分装的血液充分混匀，最好用一个微量振荡器高速振荡1min。如果无合
适的仪器，将细胞培养板及其盖紧紧固定在一起，在光滑的表面上顺时针和逆
时针各旋转10次。小心操作不要引起交叉污染，也不要让血液附在盖上。避免
血液起泡。只有刺激抗原与血液完全混合，试验才能达到最佳效果。
4.2.4孵育
将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16-24小时。
4.2.5血浆样品的收获
用可调移液器小心吸取约400µL的上层血浆，转入独立的1.5mL离心管中。
吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。污染极少量红细胞不会影响γ-干扰素酶免疫试验。
4.2.6血浆的贮存
血浆可在2-8℃贮存7天，在-20℃可贮存几个月。贮存前，每个贮存管必须用合适的盖子密封。在样品架上标记日期、操作者的首字母、管内容物、动物编号和牛群细节等相关信息。检测前，样品必须恢复至室温并充分混匀。
5. 结果
血浆上清用《牛结核γ-干扰素ELISA检测试剂盒》（青岛瑞尔）进行检测，并对结果进行分析。
6. 参考文献
[1] Wood PR, Rothel JS, McWaters PGD, Jones SL. Production and characterisation of monoclonal antibodies specific for bovine gamma interferon. Vet Immunol Immunopath, 25:37-46(1990).
[2] Wood PR, Corner LA, Plackett P. Development of a simple, rapid in vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of IFN-γ:Res Vet Sci,49:46:49(1990).
[3] Wood PR, Corner LA, Rothel JS, Baldock C, Jones SL, Coisins DB, McCormick BS, Francis BR, Creeper J, Tweddle NE. Field comparison of the interferon-gamma assay and the intradermal tuberculin test for the diagnosis of bovine tuberculosis. Aust Vet J, 68:286-290(1991).
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