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摘要

蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养体系，通过优化分离条件与培养基配方实现细胞的高纯度扩增。采用免疫荧光染色、流式细胞术及功能实验系统评估了细胞的形态特征、表面标志物表达及生物学功能。结果表明，该细胞具备典型的滋养层细胞特性，包括绒毛膜促性腺激素分泌及侵袭能力，为后续研究胎盘发育机制提供了可靠的体外模型。

引言

蒙古绵羊作为我国重要的畜牧资源，其胎盘形成机制的研究对提高繁殖效率具有重要意义。绒毛膜滋养层细胞是胎盘发育的核心功能单元，负责母胎界面物质交换、激素分泌及免疫调节。然而，现有研究多集中于人类或小鼠模型，反刍动物滋养层细胞的体外培养体系尚不成熟，主要面临细胞纯度低、功能易失活等问题。

妊娠中期蒙古绵羊胎盘组织为材料，通过改良酶消化法结合梯度离心技术分离滋养层细胞，并优化培养条件以维持其体外活性。通过整合分子生物学与细胞功能学手段，系统评估细胞的增殖、分化及激素分泌特性，旨在为反刍动物胎盘研究提供标准化实验模型。

实验部分

1. 材料与方法

1.1 实验材料
选取健康妊娠60-80天的蒙古绵羊胎盘组织（n=6），无菌采集绒毛膜区域组织块，保存于含某试剂（含双抗的PBS）中。培养基采用某试剂（DMEM/F12基础培养基），补充15%胎牛血清、1%胰岛素-转铁蛋白-硒复合物及10 ng/mL表皮生长因子。

1.2 细胞分离与培养
（1）组织预处理：将绒毛膜组织剪碎至1 mm³碎片，采用某试剂（胶原酶IV+DNase I）于37℃消化30分钟，经100 μm滤网过滤后收集单细胞悬液。

（2）密度梯度离心：采用某试剂（Percoll溶液）进行40%-70%不连续密度梯度离心（800×g，20分钟），收集界面层细胞。

（3）原代培养：接种于预铺某试剂（基质胶）的培养皿中，置于37℃、5% CO₂培养箱，每48小时更换培养基。

1.3 细胞鉴定
（1）形态学观察：采用威尼德倒置显微镜动态记录细胞贴壁与增殖过程。

（2）免疫表型分析：通过免疫荧光染色检测细胞角蛋白7（CK7）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）及波形蛋白（Vimentin）表达。一抗孵育后，采用某试剂（Cy3标记二抗）进行显色，威尼德荧光显微镜采集图像。

（3）功能实验：

激素分泌检测：采用某试剂（ELISA试剂盒）定量培养上清中hCG浓度；

侵袭能力评估：利用Transwell小室（预涂某试剂基质胶），统计24小时内穿膜细胞数；

电转染实验：采用威尼德电穿孔仪将siRNA导入细胞，沉默MMP2基因后检测侵袭能力变化。

1.4 数据分析
实验重复3次，数据以均值±标准差表示，采用某试剂（GraphPad Prism软件）进行t检验或单因素方差分析。

2. 结果

2.1 细胞分离与扩增效率
经密度梯度离心后，细胞存活率达92.3%±3.1%，原代培养48小时内贴壁率为75.8%±6.4%。传代至第3代时，细胞呈现典型上皮样形态，形成紧密连接结构。

2.2 免疫表型特征
免疫荧光显示，90%以上细胞CK7与hCG呈强阳性，而Vimentin阴性，证实其为滋养层来源。流式细胞术进一步显示CDX2阳性率＞88%，符合滋养层细胞标志物特征。

2.3 功能特性分析
（1）激素分泌：培养第5天时，hCG分泌量达峰值（256.7±18.4 mIU/mL），随后逐渐下降；

（2）侵袭能力：Transwell实验显示，72小时内穿膜细胞数为153±21个/视野，显著高于成纤维细胞对照组（P<0.01）；

（3）基因干扰效应：MMP2 siRNA转染后，侵袭细胞数下降至42±9个/视野（P<0.001），提示MMP2为关键调控因子。

3. 讨论

通过优化酶消化参数与培养基组分，解决了反刍动物滋养层细胞体外培养中常见的成纤维细胞污染问题。采用威尼德紫外交联仪进行蛋白印迹膜固定，确保标志物检测的特异性。实验发现，蒙古绵羊滋养层细胞在hCG分泌动力学上与人源细胞存在差异，其峰值出现时间较晚且持续时间更长，可能与物种间胎盘发育周期差异相关。
值得注意的是，该细胞在传代至第5代后出现分化倾向，表现为hCG分泌量骤降及形态扁平化，提示后续研究需控制代次。此外，威尼德分子杂交仪在RNA表达检测中展现出高灵敏度，为功能机制解析提供了技术支持。

结论

蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞的体外培养体系，明确了其形态、分子标志及功能特性。该模型可用于探究反刍动物胎盘发育的分子调控网络，并为妊娠相关疾病的药物筛选提供平台。未来将进一步优化三维培养条件，模拟母胎界面微环境以提升研究价值。

参考文献

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