来宝网 2025/3/11点击56次
摘要
分子克隆技术成功构建真核表达载体pSecTagEGFP，并利用威尼德电穿孔仪实现其在鸡胚成纤维细胞中的高效转染。实验验证了载体完整性及EGFP蛋白表达效率，Western blot检测显示目的蛋白特异性表达。该研究为基因功能分析与蛋白表达调控提供了可靠工具。
引言
真核表达载体是基因功能研究与重组蛋白生产的核心工具，其设计需兼顾表达效率与稳定性。pSecTag载体系统因携带分泌信号肽及多克隆位点，广泛应用于分泌型蛋白研究。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为可视化标记，可实时追踪基因表达动态。鸡胚成纤维细胞（CEF）作为经典细胞模型，具有增殖快、转染效率高等优势，但其转染条件优化仍具挑战。
pSecTag为基础骨架，插入EGFP基因，构建pSecTagEGFP重组载体，并系统优化CEF细胞的电转染参数，结合威尼德电穿孔仪的高效脉冲技术，旨在建立一种稳定、高效的基因递送体系，为后续基因编辑与蛋白分泌机制研究奠定基础。
实验部分
1. 材料与方法
1.1 载体构建
质粒提取与酶切：提取pSecTag2B母本质粒，采用XhoⅠ和EcoRⅠ（某试剂）双酶切，37℃反应3小时，威尼德紫外交联仪（0.12 J/cm²）回收线性化载体。
EGFP片段扩增：以pEGFP-N1为模板，设计含XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点的引物，通过高保真PCR扩增EGFP片段（反应体系：某试剂）。
连接与转化：将酶切纯化的载体与EGFP片段按3:1摩尔比混合，使用T4 DNA连接酶（某试剂）16℃连接12小时，转化至DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB平板。
1.2 阳性克隆筛选
菌落PCR鉴定：随机挑取单菌落，以载体特异性引物扩增，1%琼脂糖凝胶电泳验证插入片段大小。
测序验证：选取PCR阳性克隆送测序，比对EGFP序列一致性。
1.3 细胞培养与转染
CEF细胞制备：取9日龄SPF鸡胚，机械分离心脏组织，0.25%胰酶（某试剂）消化后，以DMEM培养基（含10%胎牛血清）传代培养。
电转染优化：取第3代CEF细胞，调整密度至1×10⁶ cells/mL，与10 μg pSecTagEGFP质粒混合，采用威尼德电穿孔仪（参数：电压200 V，脉宽10 ms，单脉冲），转染后立即加入预温培养基，37℃培养48小时。
1.4 表达检测
荧光显微镜观察：转染后24/48小时，威尼德倒置荧光显微镜下观察EGFP绿色荧光信号，计算转染效率（阳性细胞数/总细胞数×100%）。
Western blot分析：裂解细胞提取总蛋白，SDS-PAGE电泳后转膜，抗EGFP一抗（某试剂）及HRP标记二抗（某试剂）孵育，ECL显色检测。
2. 结果与分析
2.1 载体构建验证
酶切及测序结果显示，pSecTagEGFP载体大小为6.8 kb，EGFP基因正确插入多克隆位点。菌落PCR扩增产物与预期650 bp条带一致，测序比对无误。
2.2 转染效率优化
威尼德电穿孔仪参数优化表明，200 V电压下CEF细胞存活率达85%，EGFP表达阳性率约42%，显著高于脂质体法（15%）。荧光信号于转染后24小时显著增强，48小时达峰值。
2.3 蛋白表达验证
Western blot在27 kDa处可见特异性条带，与EGFP理论分子量一致，证实载体在CEF细胞中成功表达功能性蛋白。
讨论
优化电转染条件，显著提升CEF细胞转染效率。威尼德电穿孔仪的高效脉冲参数在保证细胞存活的同时，促进质粒跨膜递送，较传统方法更具优势。pSecTagEGFP载体可实现分泌型蛋白与EGFP的融合表达，适用于活细胞动态追踪及蛋白分泌途径研究。
结论
成功构建pSecTagEGFP真核表达载体，并建立基于威尼德电穿孔仪的CEF细胞高效转染体系。该体系为基因功能研究与重组蛋白生产提供了技术支撑，具有广泛的应用潜力。
参考文献
1. pSecTag-EGFP真核表达载体的构建及其转染鸡胚胎成纤维细胞的研究 [J] . 朱靖 ,窦如海 ,金东庆 . 实验动物与比较医学 . 2008,第005期
2. pSecTag-EGFP真核表达载体的构建及其转染鸡胚胎成纤维细胞条件的优化 [J] . 杨娜娜 ,史卫峰 ,崔英杰 . 泰山医学院学报 . 2007,第008期
3. 利用同源重组构建BMP6、BMPR1B真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究 [J] . 荣恒 ,张梦瑶 ,贺建宁 . 华北农学报 . 2020,第006期
4. 利用同源重组构建Chordin、BMP6真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究 [J] . 荣恒 ,李晶 ,柳楠 . 中国畜牧杂志 . 2020,第007期
5. 利用同源重组技术构建DKK1、BMP4真核表达载体及共转染成纤维细胞表达的研究 [J] . 张梦瑶 ,杨峰 ,刘开东 . 华北农学报 . 2018,第005期
