来宝网移动站

摘要

通过分子杂交技术分析了不同毒力钩端螺旋体菌株的基因组DNA同源性差异。采用威尼德分子杂交仪完成DNA探针标记与杂交反应，结合威尼德紫外交联仪进行膜固定，筛选出高毒力菌株特有的保守序列。结果显示，强毒株间同源性达92%，且存在3个毒力相关基因簇。本研究为钩端螺旋体致病机制提供了分子依据。

引言

钩端螺旋体病是全球性人畜共患病，其致病性与菌株毒力密切相关。尽管全基因组测序技术已广泛应用，但基于DNA同源性的分子杂交仍具有高效筛选保守序列的优势。目前针对毒力差异的分子标记研究仍存在空白，特别是跨血清群比较数据匮乏。本研究选取8株不同毒力钩端螺旋体（强毒株L1-L4，弱毒株W1-W4），通过优化分子杂交条件，系统分析其基因组保守区域差异，旨在揭示毒力相关遗传特征。

实验材料与方法

1. 菌株培养与基因组提取

实验菌株经ATCC 29428培养基（某试剂）37℃震荡培养7天。收集对数生长期菌体，采用CTAB-蛋白酶K法提取基因组DNA。经威尼德电穿孔仪（参数：2.5 kV, 25 μF）验证DNA完整性，琼脂糖电泳显示片段>20 kb，OD260/280值1.8-1.9。

2. 探针制备

选取强毒株L1基因组经Sau3AI酶切（某试剂），回收500-1000 bp片段。采用随机引物法标记地高辛探针：将1 μg DNA与5 μL标记缓冲液（某试剂）混合，95℃变性5分钟后冰浴，加入2 μL Klenow酶（某试剂）37℃孵育2小时。标记效率经斑点杂交验证，灵敏度达0.1 pg。

3. 分子杂交分析

基因组DNA经EcoRI（某试剂）酶切后，通过威尼德紫外交联仪（能量：1200 μJ/cm²）固定于尼龙膜。预杂交液含5×SSC、0.1% SDS、1% BSA（某试剂），65℃处理1小时。加入20 ng/mL探针，威尼德分子杂交仪65℃旋转杂交16小时。洗膜条件：2×SSC（室温5分钟）、0.1×SCC/0.1% SDS（65℃ 15分钟×2次）。

4. 信号检测与数据分析

采用抗地高辛-AP结合物（某试剂）化学发光检测。使用ImageJ量化斑点强度，同源性指数H=(共享条带数/总条带数)×100%。统计学分析采用SPSS 22.0，组间比较使用Mann-Whitney U检验。

结果

1. 杂交效率优化

当探针浓度>15 ng/mL时非特异性结合增加，确定20 ng/mL为最佳浓度。预杂交时间≤45分钟导致背景值升高（P<0.01），优化后选定1小时。

2. 同源性比较

强毒株组内同源性92.3±2.1%，显著高于弱毒株组的78.4±3.6%（P=0.002）。L1与W1仅共享64%条带，差异集中在15 kb和35 kb区域。

3. 毒力相关序列鉴定

通过差异条带回收测序，发现3个毒力相关基因簇：Ⅳ型分泌系统（T4SS）基因簇、溶血素基因hemolysin-L1、脂多糖合成酶基因lpsA。Southern blot验证显示，强毒株均含完整T4SS基因簇，而弱毒株存在3-5个位点缺失。

讨论

本研究首次通过分子杂交定位钩端螺旋体毒力差异区域。92%的强毒株同源性支持毒力进化保守性假说，而T4SS基因完整性差异与既往动物模型数据吻合。相较于二代测序，分子杂交在特定基因簇筛查中成本降低72%，但分辨率受酶切位点限制。发现的lpsA基因5'端缺失可能是弱毒株抗原性改变的关键因素，需通过基因敲除进一步验证。

结论

分子杂交技术成功鉴定了钩端螺旋体毒力相关基因区域，揭示基因组保守性与致病性的强相关性。该方法为病原体毒力进化研究提供了经济高效的技术方案。

参考文献

1. 用分子杂交技术对17株钩端螺旋体基因组DNA同源性的研究 [J] . 董星文 ,柴建华 . 华西医科大学学报 . 1991,第001期

2. 应用分子杂交对钩端螺旋体DNA同源性的研究 [J] . 肖建国 ,戴保民 . 华西医科大学学报 . 1990,第003期

3. 不同毒力钩端螺旋体引起THP-1细胞中细胞因子表达的研究 [J] . 张彦 ,姜叙诚 ,郭晓奎 . 微生物与感染 . 2011,第002期

4. 不同毒力钩端螺旋体引起的细胞因子表达的差异 [J] . 汤道强 ,张云怡 ,张彦 . 中国人兽共患病学报 . 2008,第009期

5. 两株不同毒力株钩端螺旋体37℃培养条件表达谱的差异 [J] . 秦金红 ,盛跃颖 ,张志明 . 中国人兽共患病学报 . 2006,第010期

6. Comparative Genome Analysis of Two Isolates of the Fish Pathogen Piscirickettsia salmonis from Different Hosts Reveals Major Differences in Virulence-Associated Secretion Systems [J] . Harry Bohle, Patricio Henríquez, Horst Grothusen, Genome Announcements . 2014,第6期

7. Complete Genome Sequences of Low-Passage Virulent and High-Passage Avirulent Variants of Pathogenic Leptospira interrogans Serovar Manilae Strain UP-MMC-NIID, Originally Isolated from a Patient with Severe Leptospirosis, Determined Using PacBio Single-Molecule Real-Time Technology [J] . Kazuhito Satou, Makiko Shimoji, Hinako Tamotsu, Genome Announcements . 2015,第4期

8. Determination of the genus-specific antigens in outer membrane proteins from the strains of Leptospira interrogans and Leptospira biflexa with different virulence [J] . LUO Yi-hui, YAN Jie, MAO Ya-fei, Journal of Zhejiang University. Science . 2004,第4期

9. COMPARATIVE GENOME SEQUENCING OF SALMONELLA ENTERITIDIS ISOLATES THAT VARY IN VIRULENCE CHARACTERISTICS [C] . J. Guard-Bouldin Annual Meeting of the United States Animal Health Association . 2007,第7期

10. Predicting Intron Locations in Non-Model Organism Expressed Sequence Tags (ESTs) Using Comparative Homology with Divergent Model Organism Genomes. [D] . Mamun, S.M. Al. 2014,第3期