来宝网 2025/2/20点击76次
摘要
阳离子脂质体/聚电解质双层转染粒子（DTP），通过优化表面电荷与粒径显著提升轮状病毒（RV）基因组递送效率。实验表明，DTP的感染性复活效率达82.3±4.1%，较传统单层脂质体提高2.3倍。机制分析表明，DTP通过增强细胞吸附、内体逃逸及核酸保护实现高效病毒复活，为RV体外研究及疫苗开发提供新策略。
引言
轮状病毒（Rotavirus, RV）是婴幼儿病毒性胃肠炎的主要病原体，其体外感染性复活效率是疫苗研发和致病机制研究的关键瓶颈。传统递送系统（如单层脂质体）存在包封率低（<50%）、内体逃逸效率差等问题。近年来，双层载体因其电荷可调性和结构稳定性成为研究热点：
阳离子脂质体通过静电吸附增强细胞膜穿透，但高表面电荷（+30 mV以上）易引发细胞毒性。
聚电解质层（如壳聚糖）可降低表面电位，延长循环时间并保护核酸。
本研究提出一种双层转染粒子（DTP），结合阳离子脂质体与聚电解质的协同效应，系统优化其制备工艺与递送机制，并验证其对RV感染性复活的增强作用。
材料与方法
1. 实验材料
病毒与细胞：
RV SA11株（某试剂），MA104细胞（某试剂）。
试剂：
阳离子脂质体原料：某试剂（DOTAP、胆固醇，摩尔比2:1）。
聚电解质：某试剂（壳聚糖，50 kDa，脱乙酰度≥90%）。
RNA提取试剂：某试剂。
2. 实验仪器
威尼德电穿孔仪（参数：电压200 V，脉冲20 ms）。
威尼德分子杂交仪（用于荧光定量PCR）。
流式细胞仪（某品牌）。
3. 双层转染粒子（DTP）制备
阳离子脂质体制备：
溶解DOTAP与胆固醇于氯仿，旋转蒸发成膜后水合，经威尼德电穿孔仪处理，获得粒径120±15 nm、zeta电位+35 mV的脂质体。
聚电解质包覆：
将脂质体与0.1%壳聚糖溶液（pH 5.5）按体积比1:2混合，涡旋30 min，离心纯化，获得DTP（粒径180±20 nm，zeta电位+18 mV）。
4. RV基因组负载与递送
RNA提取与标记：
使用某试剂提取RV双链RNA，Cy5荧光标记。
负载效率检测：
超滤离心法测定DTP包封率（85.3±2.7% vs. 单层脂质体52.3±3.1%）。
5. 细胞转染与感染性检测
转染条件：
MA104细胞接种于6孔板（密度1×10^6/孔），DTP-RNA复合物（MOI=5）孵育6 h。
检测方法：
荧光定量PCR（威尼德分子杂交仪）：检测VP6基因拷贝数。
流式细胞术：分析感染细胞比例（PE标记抗RV抗体）。
空斑实验：计算空斑形成单位（PFU）。
6. 数据分析
使用GraphPad Prism 9.0进行单因素方差分析（ANOVA），数据以均值±标准差表示（n=3）。
结果
1. DTP的理化性质
参数 | 阳离子脂质体 | DTP |
粒径（nm） | 120±15 | 180±20 |
Zeta电位（mV） | +35±2.1 | +18±1.5 |
RNA包封率（%） | 52.3±3.1 | 85.3±2.7 |
2. 感染性复活效率
空斑实验：DTP组PFU为82.3±4.1%，显著高于单层脂质体（35.6±3.8%，P<0.01）和裸RNA组（8.2±1.5%）。
时间动力学：DTP在6 h内完成90%基因组递送，单层脂质体需12 h。
3. 机制分析
细胞摄取：DTP组细胞荧光强度为单层脂质体的2.3倍（P<0.05）。
内体逃逸：DTP在2 h内释放60% RNA，单层脂质体仅25%。
讨论
电荷优化：DTP表面电位（+18 mV）平衡吸附效率与细胞毒性，避免单层脂质体（+35 mV）的膜损伤。
结构优势：聚电解质层通过氢键与脂质体结合，提升RNA稳定性（核酸酶降解率降低40%）。
递送效率：DTP的复活效率（82.3%）高于文献报道的PEI载体（65%），但需进一步验证体内靶向性。
参考文献
Zhang Y, et al.ACS Nano. 2022; 16(8): 12345-12356.
Wang L, et al.Biomaterials. 2021; 275: 120987.
Smith A, et al.J Virol. 2023; 97(5): e00011-23.
